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【摘要】 目的 评价反复冻融对不同浓度的real-time PCR质粒标准品的影响。方法 用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒，紫外分光光度计定量后，根据重组质粒分子量计算其拷贝数，稀释成梯度浓度的荧光实时定量 PCR的标准品，取1.0×106拷贝/μl、1.0×104拷贝/μl 和1.0×102拷贝/μl高中低3个浓度的标准品，反复冻融1次，6次，11次，16次和21次后，以冻融后的质粒标准品为模板同时进行real-time PCR扩增定量，比较量值变化。结果 反复冻融21次以内，高中值稳定，低浓度波动相对较大，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。结论 >1.0×104拷贝/μl的高中浓度的质粒标准品可以耐受21次以内反复冻融，低于1.0×104拷贝/μl的质粒标准品反复冻融后量值变化较大，临床使用的试剂盒所配的低浓度标准品应避免反复冻融。
【关键词】 实时定量 PCR;质粒DNA标准品
Research on stability of plasmid DNA standards for fluorescence quantification real-time PCR
WANG Heng-li, CHEN Hong-tao, KONG Mei, et al.Department of Clinical Laboratory, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangdong 519000,China
【Abstract】 Objective To evaluate freezing and thawing repeatedly influencing plasmid DNA standards for fluorescence quantification real-time PCR.Methods The recombinant PMT-18 plasmid was cloned in the Escherichia coli DH5a cells. The concentrations of plasmid stocks were determined by the Eppendorf Biophotometer, and the copy number of each plasmid was calculated based on its molecular weight. Plasmid standards were made by preparing serial 10-fold dilutions, the plasmid standards were stored at -20℃. After freezing and thawing plasmid standards 1, 6, 11, 16 and 21 times repeatedly, quantity value diversity of different concentration standards was confirmed by real-time PCR.Results Freezing and thawing less than 21 times, and there was no significant change observed in high and mid concentrations of plasmid standards, but low concentrations of plasmid standards was varied. The largest variation of high concentration plasmids was 0.06 lg, the largest variation of mid concentration plasmids was 0.18 lg, and the largest variation of low concentration plasmids was 0.34 lg.Conclusion Plasmid standards more than 1.0×104copies/μl is stable within freezing and thawing 21 times, plasmid standards less than 1.0×104copies/μl is affected after freezing and thawing repeatedly, the low concentration standard in clinical diagnosis kit should avoid freezing and thawing repeatedly.
【Key words】 real-time quantitative PCR; plasmid DNA standard
基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR快速高效，灵敏度和特异性高，无需 PCR后处理，是目前疾控系统和临床检验定量检测核酸应用最为广泛的一种方法[1～3]。实时荧光定量 PCR的质量保证最为重要的一个因素就是标准品，定量结果的准确性在很大程度上依赖于标准品的准确性。目前实时荧光 PCR定量标准品大多为重组质粒[4～7]，重组质粒为裸露的螺旋缠绕的双链闭环DNA，质粒在低温条件下可长期稳定保存，与目的基因保持较高的同源性，两者一致的扩增效率是得到较为可靠的定量结果的保证。裸露的双链DNA化学稳定，但物理结构易碎，在受到搅拌、振荡或反复抽吸时，DNA双链容易被拉断，结构被破坏后，DNA序列不再完整，参与PCR反应时扩增效率降低，影响定量[8]。反复冻融的过程中，液固状态的体积会发生变化，对DNA质粒结构会产生力学作用。本实验结合临床检验人员的工作经验，研究实时荧光定量PCR诊断试剂盒临床检测中可能的冻融次数对不同浓度的质粒标准品的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒 本研究所用的实时定量PCR的DNA重组质粒购自北京迅必达基因技术公司，质粒母液浓度>1.0×1010拷贝/μl。
1.1.2 主要试剂和仪器 质粒DNA抽提试剂盒(美国OMEGA公司);Blend Taq plus DNA聚合酶(日本TOYOBO公司);easy dilution DNA稀释液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP(日本TaKaRa公司);DTCSTM Quick Start 测序试剂盒(美国Beckman Coulter公司)。紫外分光光度计(德国Eppendorf 公司);Smartcycler II realtime PCR仪(美国Cephied公司); CEQTM8000测序仪(美国Beckman Coulter公司)。实验室自配试剂有：LB液体培养基(称取胰蛋白胨10g、酵母提取液5g、NaCl 10g，加水800～900ml搅拌至溶解。用5M NaOH调pH=7.4，定容至1L，混匀，高压灭菌，冷却后加入80mg/ml的Amp 1ml);SOC液体培养基(称取胰蛋白胨6g，酵母提取液1.5g、NaCl 0.15g，加水240ml搅拌至溶解，加入25mM KCl溶液3ml。用5M NaOH调pH=7.4，定容至300ml，混匀，高压灭菌，冷却至60℃时加入1M葡萄糖滤菌溶液6ml，加入无菌2M MgCl2溶液1.5ml);LB 含氨苄固体培养基(配制适量LB液体培养基，按照1.5g琼脂粉/100ml LB培养基的比例称取相应重量的琼脂粉，混匀后高压灭菌，待冷却至60℃时，加入Amp，铺板，制成1.5%的LB选择培养基琼脂板)。
1.1.3 引物和TaqMan探针 利用Genbank的Blast工具对插入pMD18-T质粒载体的基因序列进行分析，设计引物和探针。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中，检测探针5′端标记FAM荧光基团，3′端标记ECLIPSE荧光淬灭基团。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的克隆 取40μl DH5α感受态细胞，加入2μl所赠质粒母液并混匀，冰浴30min后，于PCR仪上42℃热激90sec，迅速置于冰上冰浴2min。将混合液接种到800μl SOC液体培养基中，37℃，<225rpm摇菌1.5h。取含Amp的90mm LB琼脂板，在琼脂板中央滴加40μl 2%X-gal和7μl 20%IPTG，无菌涂布器均匀铺开。取100μl SOC培养基细菌悬液铺板， 37℃培养过夜。从培养板上挑取单个白色菌落接种到2ml含Amp的LB培养液中，37℃摇菌过夜，转速200转/min，菌液用Omega质粒提取试剂盒抽提质粒，操作严格遵循厂家说明书进行。
1.2.2 重组质粒插入片段测序 所赠重组质粒采用TA克隆技术构建，即将特异性序列连至pMD18-T载体上。重组质粒阳性克隆培养后采用pMD18-T载体的RVM引物进行测序，所有测序步骤按照美国Beckman Coulter公司试剂盒说明书进行，利用CEQ8000软件进行序列分析，并与原目的序列进行比对。
1.2.3 定量标准品的制备 序列完全正确的重组质粒用Eppendorf紫外分光光度计定量,计算其拷贝数浓度后用1×TE(pH8.0)TE缓冲液稀释到1010拷贝/μl作为储存液，-20℃保存备用，使用时用easy dilution于冰上连续10倍稀释至浓度在1.0×10-1拷贝/μl～1.0×109拷贝/μl之间，取5μl标准品作为模板进行实时定量PCR检测。
1.2.4 实时荧光PCR反应体系的建立 反应体系为25μl, 取10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/L dNTPs 2.0μl、25μmol/L上下游引物各0.5μl、5μmol/L 探针0.5μl、Blend Taq plus DNA聚合酶1U、模板DNA 5μl，加灭菌水至终体系25μl。PCR循环参数: 94℃预变性 2min，94℃ 变性10s, 60℃延伸30s，共反应45个循环。在扩增结束后按同一条件分析数据，根据标准品生成标准曲线，确定各样本的Ct值,引入标准曲线，记录样本的拷贝数。取1.0×106拷贝/μl、1.0×104拷贝/μl 和1.0×102拷贝/μl高中低三个浓度的标准品，重复检测5次评价检测体系的稳定性。
1.2.5 实时荧光PCR检测体系评价冻融次数对质粒标准品的影响 取1.0×106拷贝/μl、1.0×104拷贝/μl 和1.0×102拷贝/μl高中低三个浓度的标准品，各分装成5μl×21管，分别编成1～21号，-20℃冻存;取各浓度标准品的1号管置于试管架上，室温融化后， 此时1号管冻融1次，试管架立即放回-20℃;取各浓度标准品2号管置于同一试管架，室温融化后， 此时2号管冻融1次，1号管冻融2次，试管架立即放回-20℃;取各浓度标准品3号管置于同一试管架，室温融化后， 此时3号管冻融1次，2号管冻融2次，1号管冻融3次，试管架立即放回-20℃;以后步骤同前，同理类推，当依次取出各浓度的第21管置于同一试管架，融化后，21号冻融1次，20号冻融2次，… …3号管冻融19次，2号管冻融20次，1号管冻融21次;取各浓度的1号管(冻融21次)，6号管(冻融16次)，11号管(冻融11次)，16号管(冻融6次)，21号管(冻融1次)进行实时荧光PCR检测，评价了反复冻融21次对不同浓度质粒标准品的Ct值及定量拷贝数的影响。
2 结果
2.1 重组质粒的克隆和测序 重组质粒在感受态细胞大肠杆菌DH5α中培养增殖后回收质粒DNA。经测序验证，插入pMD18-T载体的目的片段大小为112bp，序列为GGGTGTAATGTGAAGTAACTCGC
TACCTCACCGCGTTGTAACATCGGCTTAGAGAACCA
CAATTCTCCATTTCTTGTTACGTATACACGTAATTCC
ATTCTTACAGCGGTTT。根据插入片段我们设计了引物和探针(见表1)。
2.2 实时荧光PCR检测质粒标准品 梯度稀释质粒模板进行实时荧光PCR检测时显示，靶基因扩增反应的Ct值和模板之间均存在良好的相关性，相关性为1.0，扩增效率达到0.97。见图1。
2.3 不同浓度质粒标准品的重复性检测 高中低三个浓度的质粒标准品5次重复性实验, 高中值稳定，低浓度波动相对较大，定量结果的数值取以10为底的对数，高浓度质粒变化量极差为0.08个数量级;中浓度质粒变化量极差为0.04个数量级;低浓度质粒变化量极差为0.19个数量级(见表2)。表1 引物及探针序列表2 不同浓度质粒DNA标本检测稳定性(A)1：模板量为 5.0 × 108拷贝每反应体系的质粒 DNA;2：模板量为 5.0 × 106拷贝每反应体系的质粒 DNA;3：模板量为 5.0×104拷贝每反应体系的质粒 DNA;4：模板量为 5.0×102拷贝每反应体系的质粒 DNA;
(B)质粒标准品拷贝数对数值与CT值的相关性
2.4 冻融次数对质粒标准品的影响 高中低三个浓度的质粒标准品反复冻融1次，6次，11次，16次和21次后，进行实时定量PCR检测，结果显示，反复冻融21次以内，高中值稳定，低浓度波动相对较大，定量结果的数值取以10为底的对数，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级，见表3，图2。表3 不同冻融次数对不同浓度质粒DNA标本稳定性的影响图2 实时荧光PCR评价不同冻融次数对标本稳定性的影响
(A) 1：模板量为 5.0×108拷贝每反应体系的质粒标准品;2：模板量为 5.0×106拷贝每反应体系的质粒 DNA;3：模板量为 5.0×104拷贝每反应体系的质粒 DNA;4：模板量为 5.0×102拷贝每反应体系的质粒 DNA
3 讨论
基因扩增技术的发展使对微生物病原体的定性或定量检测的能力随之提高，以基因扩增为基础的Real-time PCR技术是主要用于科研和诊断领域的检测方法[9，10]。标准品是荧光定量PCR的必需前提，定量标准品的微小变化，会直接影响定量结果。Real-time PCR定量用的标准品通常是重组质粒[11，12]，但对于质粒标准品的稳定性及冻存复苏的影响，国内外均鲜有报道。临床检测用荧光定量PCR试剂盒，使用过程存在反复冻融几次的情况，实验人员常常担心因此影响定量结果。本研究我们首先对所用的重组质粒的插入片段进行了序列验证，序列测定证实重组质粒载体包含完整的目的片段，紫外定量后计算拷贝数浓度，制备成不同梯度的标准品，应用不同梯度的标准品得到反映核酸扩增过程的S型动力学曲线和定量标准曲线，起始模板对数与阈值循环数(Ct值)之间有着严格的相关关系(r2=1)，通过标准曲线的斜率计算出PCR的扩增效率为0.97，结果满意，因此，本实验的质粒标准品可以作为荧光定量 PCR检测的定量标准模板。反复冻融21次以内，三种不同浓度的标准品定量结果绝大部分低于原值,高中值较为稳定，低浓度波动相对较大，定量结果的数值取以10为底的对数，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。在未冻融质粒标准品的重复性实验中，低浓度标准品重复性较差，5次测定变化量极差为0.19个数量级。根据计算，变化量若超过0.3个数量级，两次定量结果相差一倍。所以，在临床检测用的试剂盒中，较高浓度的标准品只要保证冰上操作，并及时放归冰箱冻存，重复冻存21次以内不影响定量结果，低浓度标准品应避免反复冻融甚至重复使用，需重复使用时可以从较高浓度的标准品重新稀释。
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