应用PCR法快速鉴定临床体液标本中致病真菌

【摘要】  目的 用PCR法快速鉴定临床体液标本中的致病真菌。方法 应用真菌通用引物ITS4和ITS86对临床体液标本中的致病真菌进行PCR法快速鉴定，扩增产物与对照组相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果 临床体液标本直接进行PCR扩增片段的扫描分析结果与DNA扩增结果相近，差异无显著性。结论 采用ITS通用引物对临床体液标本中致病真菌进行PCR法鉴定，可准确、特异、快速、敏感地检测致病菌。

【关键词】  深部真菌感染;临床体液标本;PCR

近几年深部真菌病的发病率增高的幅度超过了过去的20年。 这些感染的死亡率高达30%～60%，有36%的真菌血症患者发生组织受累，死亡率达47%～88%，由某些真菌如曲霉和镰刀霉菌均属引起的播散性感染的死亡率接近100%[1]。早期诊断对深部真菌感染的临床结果有着重大影响，在越来越多的耐药菌株出现后，菌种鉴别的重要性已不容忽视。由于目前真菌鉴定还依赖于形态学方法，许多真菌历经数天甚至数周的培养仅获得菌属的鉴定，要鉴定到菌种尚需经过复杂的生化实验和免疫学实验，而大多数菌种，特别是丝状菌只有通过有经验的技术人员才能识别。因此，我们借助于PCR快速鉴定临床体液标本中的致病真菌，可明显缩短检测时间，更早更及时的给予感染深部真菌的患者以治疗。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 临床体液标本，经真菌镜检或培养已经证明为阳性，标本来自长海医院皮肤科真菌室。标本种类分别为胆汁1例、中段尿3例、腹腔引流液1例、胆管引流液1例和肺泡灌洗液1例。

　　1.2 主要试剂 酵母基因组DNA小量快速提取试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司); Ex Taq 耐热性DNA聚合酶;10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Free);MgC12;2.5 mmol/L mixed-dNTP;DNA Marker DL2000(均为Takara产品)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本 收集长海医院住院患者进行真菌检查的体液标本，标本经镜检或培养已证明为阳性，-20℃保存。

　　1.3.2 菌种DNA的提取 采用酵母基因组DNA小量快速提取试剂盒进行真菌DNA抽提。

　　1.3.3 样本制备 取1000μl临床含菌体液标本12000r/min，离心10min，弃上清后，沉淀用30μl三蒸水吹打均匀悬浮。

　　1.3.4 PCR引物及其分子量标准 真菌通用引物ITS4 和ITS86[2] ，其碱基序列分别为5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3’和5’- GTG AAT CAT CGA ATC TTT GAA C - 3’(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。分子量标准为DNA Marker DL2000。

　　1.3.5 PCR反应体系 总体积40μl，其中10×缓冲液4μl，25mmolMgC12 3.2μl，2.5mmol/l dNTP 3.2μl,样本 0.5μl,2×20μmol/L通用引物各1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl，三蒸水加至 40μl。

　　1.3.6 反应程序及扩增产物检测 94℃(初始变性)×10min后，以94℃60s、 55℃60s、72℃60s、循环35次，72℃充分延伸10min。取10μl扩增产物做琼脂糖凝胶电泳、EB染色，紫外灯下观察、照相。

　　1.3.7 质量控制 每次实验均设置阴性对照(灭菌三蒸水代替含菌样本本法PCR扩增)和阳性对照(酵母菌DNA抽提试剂盒的方法抽提DNA后PCR扩增)，并严格防止污染。

　　2 结果

　　应用 PCR方法对多个不同种类的临床含菌体液标本进行PCR扩增，标本种类分别为胆汁1例、腹腔引流液1例、胆管引流液1例和肺泡灌洗液1例。其片段大小同阳性对照。见图1。

　　3 讨论

　　近20年来，深部真菌感染发病率明显增加，约占院内感染的7.8% ，其中以白念珠菌所占比例最高，约为53.2%;其次为热带念珠菌(12.9%);其他深部真菌分离率均<10%[3]。深部真菌感染发生率上升的原因可能与以下因素有关：(1)广谱抗生素、免疫抑制剂、细胞毒药物的广泛应用;(2)器官移植、导管技术及静脉高营养等技术的开展;(3)严重疾病如恶性肿瘤、糖尿病和艾滋病等。艾滋病患者80% ～90%有念珠菌感染[4]。未经治疗的真菌感染病情进展快，死亡率高，尤其是重症监护病房(ICU)患者，高达30% ～80%[5]。因此，早期明确诊断是改善预后的重要方面之一。

　　为了达到早期明确诊断的目的，并直接应用于临床检测中，本实验特色之处从以下几个方面体现：(1)标本处理简便：直接取临床体液标本，经12000r/min，离心10min，弃上清后，沉淀用三蒸水吹打均匀悬浮。悬浮菌液95℃加热10min，此方法受到了真菌具有在高温下死亡的特性的启示，真菌经历足够高的温度和足够长的时间会导致真菌细胞壁的崩解，从而使DNA释放出来，并且在酵母菌和丝状菌都可以[6]，这样就不需抽提DNA，与传统的分子生物学方法相比既简化了程序、缩短了时间，又降低了实验费用和技术要求。(2)我们所使用的2对引物均为真菌通用性引物，以往的实验证明这2对引物均不能扩增细菌和人类基因的DNA[7～9] 。从扩增结果来看引物不具有属间差别，可作为真菌感染的初步检测;引物具有种属间的差异，今后可进一步用作菌种鉴定。(3)应用的PCR反应体系稳定，特异性和敏感性强，具有较强的实用性。(4)时效性好，诊断时间短，整个过程仅需5h，与传统方法相比既简化了程序、缩短了时间，又降低了实验费用和技术要求。这些优点不仅对今后的临床应用提供了方便，而且对今后可能作为直接应用于临床作为一种辅助检查提供了宝贵的经验。

【参考文献】
  　1 Goodrich JM，Reed EC, Mori M,et al. Clinical features and analysis of risk factors for invasive candidal infection after marrow transplantation. J Infect Dis, 1991 Oct,164(4):731-740.

　　2 Williams DW, Wilson MJ, Lewis MA O, et al. Identification of Candida Species by PCR and Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Intergenic Spacer Regions of Ribosomal DNA. J Clin Microbiol(Sept), 1995,33:2476-2479.

　　3 李从荣，彭少华，李栋，等.深部真菌医院感染的临床调查与耐约现状研究.中华医院感染学杂志，2002，12(7)：485-487.

　　4 Haddad NE，Powderly WG. The changing face of mycoses in patients with HIV/AIDS.AIDS Read,2001,11(7):365-8, 375-378.

　　5 Dean DA，Burchard KW.Surgical perspective on invasive candida infections.World J Surg，1998,22(2):127-134.

　　6 王英，赵敬军，陈伟，等.聚合酶链反应快速检测丝状真菌 .中国皮肤性病学杂志，2004,18(2)：123-125.

　　7 Einsele H,Hebart H,Roller G,et al. Detecion and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes.J Clin Microbiol, 1997,35(6):1353-1360.

　　8 Williams DW, Wilson MJ, Lewis MA ,et al.Identification of Candida Species by PCR and Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Intergenic Spacer Regions of Ribosomal DNA. J Clin Microbiol, 1995,33(9):2476-2479.

　　9 Turenne CY, Sanche SE,Hoban DJ,et al.Rapid identification of fungi by using the ITS2 genetic region and an automated fluorescent capillary electrophoresis system. J Clin Microbiol, 1999,37(6):1846-1851.