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The morphological studies of absorption way of gentamicin in proximal tubule
Mu Changzheng，Wang Xiaomei，Tao Shiying，et al.
Department of Histology and Enbryology，Jinzhou Medical College，Jinzhou121001.
【Abstract】 Objective To investigate the absorption way of gentamicin in proximal tubule.Methods Rats were randomly divided into two groups:the experimental group received3H-gentamicin which was injected into proxi-mal tubule and the control group received gentamicin.According to the time after the operation，each group was further divided into two groups:five minutes group and twenty minutes group.The thin section of light and electron microscope autoradiography was made，observed and analyzed.Results Light microscope revealed silver granules was located in the top of proximal tubule five minutes postoperatively.After twenty minutes，silver granules increased obviously and was found in the middle of proximal tubule.There was not silver granules in the control group.Electron microscope showed silver granules was mainly in vesicle，vacuole and dense top small tubule.Silver granules increased more sig-nificantly in twenty minutes group than five minutes group.Conclusion Gentamicin may connect with receptor in the top of proximal tubule epithelium.It may be transmitted into lysosome and accumulated here through vesicle，vacuole and dense top small tubule.
【Key words】 gentamicin kidney prximal tubule autoradiography
众所周知，庆大霉素有着广泛的抗菌作用，但其肾脏和内耳毒性往往让临床医生望而却步，一直以来庆大霉素吸收机制尚未定论。因此研究庆大霉素在肾脏的吸收途径，对减少其在肾脏的吸收，增强抗菌作用，减少和消除毒性具有重要的意义 ［1］ 。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体重230～270g，由锦州医学院实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 硫酸庆大霉素购于美国Sigma公司， 3 H-庆大霉素由比利时Dupont NEN研究合成，其放射性活度为10 7 Bq/μmol。
1.3 活体肾小管显微穿刺实验 24只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，每组又分注射5min组、注射20min组，因此共分四组，每组6只。实验前大鼠自由饮水，节食12h，Inactin（150mg/kg体重）腹腔麻醉后，被放置在衡温加热台上。气管插管术后，右颈静脉持续滴注生理盐水（3.8ml/h）。侧切暴露左肾并将肾脏放在一个被加热的恒温杯中，而后用液体石蜡将其肾脏覆盖，输尿管插管并开口于一个试管中，肾周围的温度保持在37℃～38℃。将 3 H-庆大霉素5000CPM在2min内显微注入肾近端小管，对照组注入硫酸庆大霉素 ［2］ 。
1.4 放射自显影实验 3 H-庆大霉素注入肾近端小管腔后，间隔5min、20min后，用1%戊二醛分别固定各自的肾小管，摘除肾脏，将含有显微穿刺的肾小管取出，1%锇酸后固定1h，逐级酒精脱水，Epon812包埋，半薄、超薄切片，铀铅双重染色。光镜放射自显影切片，浸入LM-1乳胶7～8s，置4℃冰箱中1～2周，柯达D-19显影液显影、硫代硫酸钠定影、甲苯胺兰染色，显微镜观察并摄影。电镜放射自显影切片，碳喷镀后，利用金属套环法将Ilford-l 4 核乳胶涂片。放置4℃冰箱中保存2～3个月，经显影、定影，JEM-1200型电子显微镜观察。
1.5 图像分析 用CIAS-1000细胞图像分析系统对各组小鼠肾近端小管光镜放射自显影染色结果进行图像分析，每组取15张切片，每张切片取10个视野，将放射自显影颗粒信号投射到CIAS-1000细胞图像分析分析仪荧光屏上，以灰度值来表示放射自显影颗粒，灰度值越大表示放射自显影颗粒越少。采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，计量资料用ˉx±s表示，组间比较采用q检验。
2 结果
光镜放射自显影显示: 3 H-庆大霉素注入近端小管5min后，放射自显影银颗粒广泛分布于近端小管刷状缘的底部，上皮细胞的顶部（图1）;20min后，中部也可见银颗粒（图2），图像分析结果显示近端小管中银颗粒比5min时明显增多（P<0.01），见表1。远端小管、细段及集合小管等均未见特异颗粒;对照组近端小管未发现银颗粒存在。
图1 3 H-庆大霉素注入近端小管5min后，放射自显影银颗粒广泛分布与近端小管刷状缘的底部，上皮细胞的顶部。（LM×400）
图220min后，中部也可见银颗粒。（LM×400）
表1 大鼠注射 3 H-庆大霉素后不同时间放射自显影染色灰度评分 （略）注:与背景比较 * P<0.05;与背景比较 ** P<0.01;与注射5min组比较 # P<0.05电镜自显影显示: 3 H-庆大霉素注入近端小管5min后银颗粒集中分布在内吞小泡、大泡和致密顶端小管中（图3），偶尔可见银颗粒出现在溶酶体中;20min组溶酶体中银颗粒明显增多（图4）。
3 讨论
一般认为，庆大霉素是在肾近端小管吸收，但其吸收途径的动态观察一直缺少形态学证据 ［3，4］ 。本实验利用活体大鼠肾小管显微穿刺技术，采用放射自显影方法对庆大霉
图3 3 H-庆大霉素注入近端小管5min后银颗粒集中分布在内吞小泡、大泡和致密顶端小管中，偶尔可见银颗粒出现在溶酶体中。（EM×5000）
图4 20min组溶酶体中银颗粒明显增多。（EM×5000）
素在肾近端小管的吸收途径进行了观察。光镜和电镜放射自显影显示:肾近端小管显微注入 3 H-庆大霉素5min后放射自显影颗粒集中在上皮细胞顶部的内吞小泡、内吞大泡和致密的顶端小管中，而这些细胞器均与近端小管上皮细胞内吞吸收和膜循环相关，随着时间的推移20min后银颗粒不断增多，并大量分布在溶酶体内。由此，我们可以推论庆大霉素可能与近端小管上皮顶部某种受体—膜蛋白结合，通过内吞小泡、大泡和致密顶端小管传送至溶酶体并可积聚于此。因此，庆大霉素在近端小管的吸收是由上皮的内吞吸收，即经过近端小管上皮膜循环有关的细胞器传递来完成的。庆大霉素对肾脏的毒性作用可能主要是积聚在溶酶体内的庆大霉素过量，溶酶体负荷过重，未能及时清除之，导致溶酶体渗漏、溶解所致 ［5］ 。
参考文献
1 黄巨恩，徐志文，陈纤，等.庆大霉素毒性作用对肝肾的影响及其保护的形态学研究.解剖学进展，2000，6（3）:303-305.
2 Shiying，Plerre JV，et al.Soren K，et al.Megalin/gp330mediaetsuptake of albumin in renal proximal ule.Am.J.Physiol.271（Renal Fluid Electrolyte Physiol.40）:F900-907，1996，7（3）:457-460.
3 Decorti G，Malusa N，Furlan G，et al.Endocytosis of gentamicin in a proximal tubular renal cell line.Life Sci，1999，65:1115-1118.
4 付鹏，崔若兰，于光，等.庆大酶素诱导LLc-pk1细胞凋亡的实验研究.中华临床医药，2002，8（3）:453-455.
5 黄全勇，黄巨恩.庆大霉素对培养的肾小管上皮细胞毒性作用的研究进展.解剖学研究，2003，25（1）:34-35.
作者单位:1121001辽宁锦州锦州医学院组织学与胚胎学教研室
121001辽宁锦州锦州医学院附属第一医院高级医疗中心