Literature
首页合作平台在线期刊中华中西医杂志2005年第6卷第6期论著

雄黄对白血病细胞bcl-2和Fas蛋白的表达影响的研究

来源:INTERNET
摘要:【摘要】目的检测雄黄诱导白血病细胞凋亡的能力,并探讨其分子机制。方法应用形态学观察检测细胞凋亡,应用检测流式细胞仪白血病细胞bcl-2和Fas蛋白的表达。结果雄黄可诱导白血病细胞发生典型的凋亡,白血病细胞有bcl-2强表达,同时雄黄可使白血病细胞bcl-2蛋白表达呈时间依赖性的下降。白血病细胞有较弱的Fas蛋白......

点击显示 收起

  【摘要】 目的  检测雄黄诱导白血病细胞凋亡的能力,并探讨其分子机制。 方法  应用形态学观察检测细胞凋亡,应用检测流式细胞仪白血病细胞bcl-2和Fas蛋白的表达。 结果  雄黄可诱导白血病细胞发生典型的凋亡,白血病细胞有bcl-2强表达,同时雄黄可使白血病细胞bcl-2蛋白表达呈时间依赖性的下降。白血病细胞有较弱的Fas蛋白表达,随着雄黄与白血病细胞作用时间的延长,未见Fas蛋白表达有明显改变。 结论  雄黄通过影响白血病细胞bcl-2蛋白的表达从而导致白血病细胞发生凋亡是其治疗白血病的重要分子机制。

    Study of expression of bcl-2and Fas protein of

    leukemic cells as induced by realgar  Huang Wangxiang,Chen Jianxia,Luo Ling,et al.

    The Central Hospital of Longgang,Shenzhen518116.
   
    【Abstract】 Objective To investigate the apoptosis of leukemic cells induced by realgar,and illustrate the possibe molecular mechanism.Methods Apoptosis was detected by morphological observation,BCL-2and Fas ex-pression was detected by flow cytometric analysis.Results There was strong expression of bcl-2in leukemic cells.Realgar can induce leukemic cells to apoptosis and down-regulated bcl-2expression.Fas protein expression in leukemic cells was very low,realgar induced apoptosis of leukemic cells,but didn't induce Fas protein expression.Conclusion Realgar can induce apoptosis in leukemic cells.Down-regulation of bcl-2expression appears to play an important role in the apoptosis of the differentiated leukemic cells.

    【Key words】 realgar bcl-2protein Fas protein apoptosis leukemia

    在20世纪50年代,国内就试用雄黄治疗白血病并取得肯定疗效,且逐渐引起医学界的重视,但关于其治疗的作用机制,资料文献报道少。我们通过一定浓度雄黄对白血病细胞作用不同时间,随后涂片观察凋亡细胞及凋亡小体,以及用流式细胞仪检测细胞bcl-2和Fas蛋白的表达,试图阐明雄黄治疗白血病的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 制剂与试剂 雄黄(realgar,二硫化二砷As 2 S 2 )购于湖北中医院,试验时用0.5%纤维钠素配成混悬液;RPMI-1640购于Sigma公司;免疫组化试剂盒购于福州迈新公司,用细胞涂片仪(shandon产品,500r/min,4min)涂片,室温干燥。bcl-2鼠抗人单抗购于Santa公司;Fas鼠抗人单抗购于丹麦Dako公司。

    1.2 细胞培养 取30例白血病初诊患者(M 1 4例,M 2 3例,M 3 8例,M 4 13例,M 5 4例)。骨髓经Ficoul分离出单个细胞,以2×10 5 /ml的浓度接种于新鲜RPMI1640培养液(内含10%小牛血清,100μg/ml青霉素和100mg/ml链霉素)中培养(37℃,5%CO 2 )。设20例正常人骨髓作为对照组。

    1.3 结果检测 培养细胞与一定浓度雄黄(20μg/ml)孵育一定时间后(1)用细胞涂片仪(shandon产品,500r/min,4min)涂片,室温干燥。涂片经WRIGHT'S染色,显微镜下观察。(2)流式细胞仪检测bcl-2和Fas蛋白的表达。收集1.5×10 9 cells/L,用含70%乙醇的PBS1ml渗透细胞30min,冲洗2次,弃上清,加含1%牛血清白蛋白的PBS于4℃悬浮10min,13000r/min离心15min,弃上清。加Bcl-2或Fas单抗(1:50稀释)100μl,4℃下孵育30min,PBS洗2次。加FITC标记的羊抗鼠IgG(1:200稀释)100μl,4℃下孵育30min,PBS洗2次。用PBS代替单抗作阴性对照,立即进行流式细胞仪检测,观察阳性细胞百分率和荧光密度的变化。然后根据如下公式计算平均荧光强度比率(MFI比率)。MFI比率=标记单抗的样品的平均荧光密度/未标记单抗的阴性对照的平均荧光密度。

    1.4 统计学处理 数据用均数±标准差(ˉx±s)表示。两样本均数间的差异显著性检验用t检验。

    2 结果

    2.1 形态学观察 细胞经雄黄处理后,出现具有典型凋亡形态特征的细胞。表现为细胞体积缩小,胞浆浓缩,胞核固缩,染色质凝集,核碎裂,形成凋亡小体,具有上述形态特征的细胞随雄黄处理时间延长而逐渐增多。

    2.2 雄黄对白血病细胞Bcl-2表达的影响 流式细胞仪检测阳性细胞百分率和荧光密度的变化用雄黄处理白血病细胞0~24h,于不同时点收集细胞,分别与Bcl-2单抗及FITC标记的羊抗鼠第2抗体作用后立即进行流式细胞仪检测,见表1。从表1可以看出,在0h,白血病细胞Bcl-2表达的阳性率为96%,随着雄黄作用时间延长,阳性百分率逐渐下降,当作用24h阳性率下降为77.1%,与0h比较有显著差异(P<0.01)。此外,根据荧光密度计算出的MFI比率也呈明显下降,由0h的8.93下降至24h的5.87,两者间比较有显著差异(P<0.01)。

    2.3 雄黄对白血病细胞Fas蛋白表达的影响 流式细胞仪检测阳性细胞百分率和荧光密度的变化,雄黄处理白血病细胞0~24h后收集细胞,分别与Fas单抗及FITC标记的 羊抗鼠IgG作用后立即进行流式细胞仪检测,结果如表2。从表2可以看出0h,白血病细胞Fas蛋白表达的阳性百分率为87.9%,随着时间延长,阳性百分率变化不显著(P>0.05)。此外根据荧光密度计算出的MFI比率无明显变化(P>0.05)。

    表1 流式细胞仪检测雄黄对白血病细胞bcl-2表达的影响(略)注:患者与对照组相比或作用不同时间之间相比 ▲ P<0.01

    表2 流式细胞仪检测雄黄对白血病细胞Fas蛋白表达的影响(略)注:患者与对照组相比或作用不同时间之间相比 ▲ P>0.05

    3 讨论

    雄黄为含砷的结晶物[二硫化砷(As 2 S 2 )]。早在50年代国内就试用雄黄治疗白血病,以含有雄黄成分的中成药,如复方青黛片、六神丸及梅花点舌丹等治疗白血病,都取得了一定的治疗效果。雄黄治疗白血病,可引起血液系统的变化。黄世林 [1] 等以复方青黛片治疗急性早幼粒细胞白血病,主要成分雄黄可引起骨髓中粒细胞呈退行性变。张鹏 [2] 等以三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病过程中,注意到血细胞的凋亡现象,而且抑制细胞增殖,我们的实验结果也表明,雄黄与白血病细胞作用后,可引起凋亡细胞和凋亡小体的出现。bcl-2是一种细胞凋亡抑制基因,在髓系造血细胞中的表达水平与细胞分化程度有关,随正常髓系造血细胞分化逐渐降低 [3] 。正常造血细胞终末分化后,最终通过凋亡得以清除 [4] 。白血病是造血干、祖细胞分化受阻于不同阶段的结果。白血病细胞表现为分化不全或去分化特征,其终末分化相关凋亡过程也被抑制,某些化疗药物可使白血病细胞重新分化、成熟,象正常成熟细胞一样凋亡,最终得以消除。已有实验证明bcl-2表达失调在某些白血病和淋巴瘤的发病中起重要的作用 [5,6] 。为了进一步探讨细胞凋亡发生的分子学机制,我们同时用流式细胞仪检测了雄黄与白血病细胞作用不同时间后bcl-2的表达,结果显示:bcl-2在白血病细胞有强表达,白血病患者bcl-2蛋白阳性表达细胞百分数远高于正常骨髓细胞(P<0.01),随着与雄黄接触时间的延长,bcl-2的表达量在白血病患者骨髓中呈明显下降,差异有显著性意义(P<0.01),说明雄黄诱导白血病细胞的凋亡与bcl-2的下调有关。Fas是TNF受体家族的一个受体,为相对分子质量45×10 3 的膜蛋白,广泛表达于人体各种细胞。抗Fas抗体、细胞膜表面FasL均可结合细胞表面Fas,导致细胞凋亡 [7] 。Fas/FasL系统是启动细胞凋亡的一条重要的途径。有资料表明抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡可能有Fas系统的参与,许多化疗药物能诱导FasL的表达。也有一些相反的看法,认为化疗药物诱导的凋亡与Fas系统无关。本试验也发现白血病细胞虽然表达Fas蛋白,但表达量少,且雄黄在诱导白血病细胞凋亡过程中未发现Fas蛋白表达改变。结果说明,雄黄诱导的白血病的凋亡与Fas/FasL系统无关。我们的试验充分表明细胞凋亡路径障碍在白血病的形成和维持中具有重要的病理生理意义,雄黄可通过使白血病细胞bcl-2蛋白的表达下调,细胞凋亡加速得以清除,从而重建正常的凋亡路径而发挥其治疗作用。Fas系统则在其凋亡过程中未发挥作用。

    参考文献

    1 黄世林,郭爱霞,向阳,等.复方青黛片为主治疗急性早幼粒细胞白血病的临床研究.中华血液学杂志,1995,1:26.

    2 张鹏,王树叶,胡金虎,等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志,1996,2:58.

    3 Deua D,Soligo D.Bcl-2proto-oncogene expression innormal and neoplastic human myeloid cells.Blood,1992,79:1291.

    4 Whyte MB,Meeayher C,MacDermot J,et al.Impairment of function in aging neutrophils in associated with ptosis.Immunol,1993,150:5124.

    5 De Maria R,Testi R.Fas-FasL interactions:a common pathogenetic mechanism in organ-specific autoimmunity.Immunol Today,1998,19:121-125.

    6 Kusenda J.Bcl-2family proteins and leukaemia.Neoplasma,1998,45 (3):117-122.

    7 Ying S,Khan LN,Meng Q,et al.Cyclosporin A,apoptosis of BALT-cells and expression of Bcl-2in asthmatic.Eur Respir J,2003,22(22):207-212.

    作者单位:1518116广东省深圳市龙岗中心医院
    430060武汉大学人民医院血液科

作者: 黄望香 陈建霞 罗 玲 高清平 2005-6-14
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具