河北地区TTV感染与其它病毒性肝病的关系

　　【摘要】 目的  检测健康人群及肝病患者TIV感染状况。 方法  采用TTV（N22）区核苷酸序列设计引物，建立半巢式PCR（nPCR）方法，对309例7种不同人群血清检测TTV DNA。 结果  TTV在非甲-非戊型肝炎、肝硬化患者、丙型肝炎、急性甲型肝炎、慢性乙型肝炎、急性乙型肝炎和健康人群中感染率分别为75.00%（15/20）、75.00%（27/36）、61.90%（13/21）、58.06%（18/31）、52.78%（38/72）、45.61%（26/57）和38.89%（28/72）。肝硬化患者及非甲-非戊型肝炎感染率明显高于正常人群（P<0.01），也明显高于急性乙型肝炎及慢性乙型肝炎P<0.05。21～30岁年龄组TTV感染率（39.06%）显著低于51～60岁年龄组感染率68.75%（P<0.01），其它年龄间无差异。急性甲型肝炎、急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎与丙型肝炎之间均无统计学意义，性别之间亦无统计学意义。 结论  TTV在河北地区健康人群及肝病患者中有较高的感染率。TTV感染与不明原因ALT升高有一定的关系。
     
　　TTV infection and the association with other viral liver diseases in Hebei area
     
　　Chen Shufen，Han Zhanying，Liang Shuxin，et al.
   
　　Hebei Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang050021.
   
　　【Abstract】 Objective To detect the infection state of TTV in healthy population and patients with liver dis-eases.Methods Netsted Polymerase Chain Reaction（nPCR）was established with the primers designed according to the N22region of TTV.309person's which came from7different population were detected for TTV DNA with PCR.Results The infection rates of TTV in nonA-nonE hepatitis，cirrhosis，hepatitis C，acute hepatitis A，chronic hepati-tis B，acute hepatitis B and healthy population group was75.00%（7/20），75.00%（27/36），61.90%（13/21），58.06%（18/31），52.78%（38/72），45.61%（26/57），and38.89%（28/72）respectively.The infection rate of TTV in cirrhosis patients and non A-non E group was significantly higher than that in the healthy populations（P<0.01），acute hepatitis B（P<0.01）and chronic hepatitis B（P<0.05）.Moreover，TTV infection rate in people aged21～30（39.06%）was significantly lower than that in people aged51～60（68.75%，P<0.01）.No significant differ-ences were found between other aged groups.The infection rate in hepatitis C had no significant difference with in a-cute hepatitis A，B and chronic hepatitis B group.There was no insignificant difference in sex，either.Conclusion The infection rate of TTV in healthy population and patients with liver disease was high.TTV infection had certain re-lation with unknown increase of ALT.
   
　　【Key words】 TTV PCR sera epidemiology
      
　　TT病毒（TTV）是一种单链DNA病毒，自1997年底日本学者从1例输血后非甲-非戊型肝炎病人的血清中分离出TTV以来 ［1］ ，各国学者对TTV的研究日益深入，1998年初我国学者周育森等 ［2］ 亦从非甲-非戊型肝炎病人血清中分离出TTV。同年Okamoto ［3］ 报道了TTV全基因序列。TTV在不同地区的检出率差异很大，为了解TTV在河北地区不同人群中的感染状况，分析TTV与肝病的关系，我们选择N22区引物，应用nPCR方法对正常人群和甲、乙、丙型肝炎患者，不明原因肝炎患者及其他肝病患者进行了TTV DNA检测，结果如下。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 调查人群与标本来源 非甲-非戊型肝炎病人血清标本、乙型肝炎病人血清标本收集于保定市传染病医院和河北省职工医学院附属医院住院及门诊病人。甲型肝炎病人血清收集于各地市送检的抗-HAV IgM强阳性急性甲肝病人，丙型肝炎血清来自河北固安单采浆患者，正常人血清来自唐山市、石家庄市和保定市健康体检人群。全部病例均有典型的临床症状和不同程度的ALT升高。所有血清标本于-70℃冰箱保存。
   
　　1.2 引物设计 根据Okamoto等 ［3］ 报道的TTV基因序列在N22区设计引物，由北京赛百盛基因技术有限公司合成引物。引物序列为: PT15′-CAGACAGAGGAGAAGGCAAC-3′PT25′-CCTCCTGGCATTTTACCATT-3′PT35′-ACATGTTATGGATAGACTGG-3′其中PT1与PT2为外引物，PT3与PT2为内引物。
   
　　1.3 主要试剂 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，DNA提取试剂购自广州华银基因科技有限公司。DNA Maker为赛百盛基因技术有限公司。PE9700型DNA扩增仪系美国PE公司产品，GOL DOC2000型凝胶成像系统为美国BIO RAD公司产品，台式冷冻离心机购自德国HERMLE公司。
   
　　1.4 实验室各项肝病感染指标的检测 肝功能等生化指标用全自动生化分析仪检测。抗-HAV IgM、HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、抗-HCV检测均采用ELISA方法，所有试剂购自万泰生物工程公司。

　　1.5 统计学分析 采用卡方（χ 2 ）检验。
   
　　1.6 SENV DNA提取 取120μl STG裂解缓冲液和60μl血清标本加入0.5ml离心管中，充分混匀，98℃水浴加热10min，室温平衡5min，加180μl异丙醇，充分混匀，13000g离心沉淀8min，弃上清，沉淀加150μl KW缓冲液，颠倒混匀，13000g离心去上清，室温风干，沉淀用20μl样本稀释液重悬，80℃温浴2min，离心30s，取上清作为DNA模板。
   
　　1.7 巢式PCR反应条件 第一次PCR反应体系为30μl，取DNA模板5μl，10×PCR Buffer3μl，1UTaq DNA聚合酶，dNTP200μmol/L，Mg 2+ 1.5mmol/L，引物PT1和PT2均为0.05μmol/L。扩增程序为94℃预变性180s，94℃45s，56℃45s，72℃50s，30个循环，72℃延伸7min，取第一次PCR扩增产物1μl作为第二次PCR模板，引物为PT3和PT2;其余试剂同第一次PCR反应体系，反应体积为50μl，扩增程序为94℃预变性180s，94℃45s，58℃45s，72℃50s，30个循环，72℃延伸7min。每次PCR均设阳性及阴性对照。
   
　　1.8 产物检测 取第二次PCR反应产物8μl，用2%琼脂糖凝胶电泳，Gold View核酸染料染色，用凝胶成像系统观察结果。出现273bp DNA扩增带者阳性。

　　2 结果
    
　　2.1 PCR产物电泳结果 经nPCR获得的第二轮阳性产物长度为272bp，7种不同人群扩增产物经检测与目的基因片段分子量相符（图1）。
 
　　图1 TTV nPCR产物结果（略）
    
　　1.急性甲型肝炎;2.阴性对照;3.急性乙型肝炎;4.慢性乙型肝炎;5.非甲-非戊型肝炎;6.丙型肝炎;7.肝硬化标本;M:Marker
    
　　2.2 肝病患者与非肝病患者TTV感染率的比较 309例血清中TTV DNA总感染率为53.40%，7种人群中TTV DNA感染率的高低依次为非甲-非戊型肝炎75.00%（15/20）、肝硬化患者75.00%（27/36）、丙型肝炎61.90%（13/21）、急性甲型肝炎（58.06%）（18/31）、慢性乙型肝炎52.78%（38/72）、急性乙型肝炎45.61%（26/57）和正常人群38.89% （28/72）。肝硬化患者和非甲-非戊型肝炎患者感染率与正常人群比较差异有非常显著性P<0.01，也明显高于急性乙型肝炎及慢性乙型肝炎（P<0.05）。急性肝炎及慢性肝炎与丙型肝炎之间均无统计学意义（见表1）。
    
　　表1 不同人群TTV DNA感染率（略）
    
　　注:5、6与2、7比较，P<0.01，3与5、6比较，P<0.05

　　2.3 TTV感染者性别与年龄的比较 309例检测对象男性TTV感染率为56.86%（116/204）高于女性的46.67%（49/105），在165例TTV感染者中男116例，占全部阳性例数的70.30%，女性49例，占全部阳性例数的29.70%。两组之间比较无统计学意义（P>0.05），不同年龄组TTV DNA感染率51～60岁年龄组（68.75%）明显高于21～30岁年龄组（39.06%）（P<0.01）。其它年龄间无统计学意义（见表2）。
    
　　表2 各组人群不同性别、年龄组TTV感染情况（略）
    
　　3 讨论
      
　　TTV自发现以来，许多国家学者报道在当地也发现TTV感染者 ［4，5］ ，其在各人群的感染率及对肝脏的致病性均得到了广泛的研究，我国学者也获得了我国TTV感染情况 ［6，7］ ，综合各国的研究资料可以看出，TTV为世界性分布而且感染率比较高。TTV在各国及各人群感染率研究报告差异也较大 ［8］ ，Charlton等 ［4］ 报道美国献血员TTV感染仅为1%，多数研究结果显示一般人群TTV DNA阳性率在10%以上。我国周伯平等 ［9］ 用NG059和NG060及NG063引物，测得TTV阳性率在非甲-非戊型肝炎患者为52.5%。我们用N22引物，发现非甲-非戊型肝炎患者的感染率（75.00%）明显高于前者，也高于我国 ［10］ 北京（28.9%）、深圳（48.6%）、南京（60.00%）和沈阳（55.0%）。可见河北地区非甲-非戊型肝炎患者中确实存在TTV DNA，提示TTV可能是导致非甲-非戊型肝炎的病原体。国外研究认为，丙型肝炎病毒感染者合并TTV感染的概率显著高于其它肝炎病毒感染者 ［11］ ，在我们实验中发现丙型肝炎病毒感染者合并TTV感染的阳性率高于乙型肝炎病毒感染者，近似于刘卫东等 ［12］ 报道的中国慢性丙型肝炎患者的感染率（68.00%）。说明TTV感染与HCV感染可能存在一定的关系，也可能与引物稍有差异或取材地区及人群不同等有关。
   
　　本文研究结果显示出在有明显的肝损害患者中TTV检出率高，其高低似与疾病的严重性有关，在TTV DNA阳性患者组肝硬化患者明显高于急性乙肝与慢性乙肝。说明TTV重叠感染可以加重乙型肝炎患者的病情。虽然国内外大多数学者都认为TTV无明显的致病性 ［13，14］ ，但也有不少学者持相反意见 ［15］ ，有学者认为TTV的致病性可能与基因变异有一定关系 ［3］ 。本实验未对检测出的TTV DNA进行分型检测，所以不能区分导致急性、慢性、肝硬化及不明原因性肝炎TTV DNA型及亚型的区别，但此实验可说明TTV具有一定的致病性。
     
　　参考文献
    
　　1 Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，et al.A novel DNA virus（TTV）associated with elevated transaminase levels in post transfusion hepatitis of unknown etiology.Biochern Biophys Res Commun，1997，241:92-97.
   
　　2 周育森，何中平，董京芳，等.中国人TTV部分基因克隆及序列测定.军事医学院院刊，1998，22:107-109.
   
　　3 Okamoto H，Nshizawa T，Kato N，et al.Molecμlar cloning and character-ization of a novel DNA virus（TTV）associated with post transfusion hep-atitis of unknown etiology.Hepatol Res，1998，10:1-6.
   
　　4 Tanaka H，Okamoto H，Luengrojanakμl P，et al.Infection with an unen-veloped DNA virus（TTV）associated with post transfusion non-A to G hepatitis.Patients and healthy blood donors in Thailand.J Med Virol，1998，56:234-238.
    
　　5 Okamura A，Yoshioka M，Kubota H，et al.Detection of a novel DNA virus（TTV）sequence in peripheral blood mononuclear cells.J Med Vi-rol，1999，58:174-177.
   
　　6 张晋红，陈士林.中国人TTV感染的流行病学.世界华人消化杂志，2001，9:1384-1390.
   
　　7 朱元民，刘玉兰，王宇，等.北京地区非甲-非戊型肝炎转氨酶升高患者病因研究.世界华人消化杂志，2000，8:1192-1194.
   
　　8 Sugiyama K，Goto K，Ando T，Mizutani F，et al.TT virus infection in Japanese children:isolates from genotype1are over represented in pa-tients with hepatic dysfunction of unknown etiology.Tohoku J Exp Med，2000，191:233-239.
   
　　9 周伯平，马卫民，王火生，等.深圳地区不同人群TTV感染情况的调查.实验和临床病毒学杂志，1998，12:241-244.
   
　　10 周育森，董京芳，周乙华，等.中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学.中华预防医学杂志，1998，32（6）:352-355.
   
　　11 Sugiyama T，Shimizu M，Yamauchi O，et al.Seroepidemiological survey of TT virus（TTV）infection in an endemic area for hepatitis C virus.Nippon Rinsho，1999，57:1402-1405.
   
　　12 刘卫东，波田寿一，徐辉，等.中国和日本部分地区TT病毒的检出率及基因亚型分析.实验和临床病毒学杂志，2000，14（2）:169-172.
   
　　13 赵西平，沈汉馨，王宝菊，等.TTV HCV重叠感染时TTV无明显致损伤作用.世界华人消化杂志，2001，9:86-87.
   
　　14 Kadayifci A，Guney C，Uygun A，et al.Similar frequency of TT virus infection in patients with liver enzyme elevations and healthy subjects.J Clin Pract，2001，55:434-436.
   
　　15 Gad A，Tanaka E，Oreii K，et al.Clinical significance ofTTvirus infec-tion in patients with chronic liver disease and volunteer blood donors in Egypt.J Med Virol，2000，60（2）:177-813. 

　　作者单位:050021河北省疾病预防控制中心病毒科
   
　　　　　　　071000河北保定河北省职工医学院附属医院