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1 资料与方法
1.1 一般资料 在本院就诊RA患者28例，男5例，女23例，年龄21～67岁，平均年龄38岁，病程6个月～19年，平均7.8年。所有病人均符合美国风湿病学会1987年的RA诊断标准 ［3］ ，且病情处于活动期。病人取空腹外周血，分离血清后置-20℃冰箱保存备用。对28例患者中11例有膝关节积液的患者，在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，1000r/min，离心10min，取上清液置-20℃冰箱保存备用，沉淀用无菌PBS洗3次后，收集滑液中炎性细胞，同时收集并记录RA的临床资料，包括晨僵时间、握力、关节肿胀指数、关节压痛指数、关节X线病变程度、血沉、C反应蛋白（CRP）和类风湿因子（RF）等实验室检查结果。
另选骨关节炎（OA）患者21例作为对照，其中男7例，女14例，年龄36～78岁，平均年龄45.2岁，病程1.2～15年，平均9.6年。对并发膝关节积液的6例OA患者，同时行膝关节穿刺，抽取关节液分离上清和细胞。
1.2 CCL5测定 CCL5测定采用ELISA方法，CCL5定量测定试剂盒（美国R&D公司生产）测定敏感度为3.1pg/ml，操作按试剂盒说明书进行。
1.3 外周血白细胞和滑液炎性细胞体外产生CCL5的研究 对抽取关节液的11例RA和6例OA患者，另取外周抗凝血10ml，离心去血浆后加2倍体积冷无菌0.2%氯化钠溶液，振荡混匀10s后迅速加入等体积无菌1.6%氯化钠溶液，在4℃，1000r/min，离心5min，去上清，重复裂解红细胞1～2次，用无菌冷PBS洗2次后，加2ml RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）悬浮沉淀细胞，混匀后取10μl行台盼兰染色，活细胞计数。收集到的外周血白细胞和滑液炎性细胞用上述培养液稀释成10 5 /ml，按每孔0.5ml接种于24孔培养板，置含5%CO 2 孵育箱中，于37℃培养48h，收集上清，按上述ELISA测定CCL5。
1.4 统计学处理 两组间计数资料用t检验，血清CCL5水平与临床及实验室指标的相关性分析采用直线相关回归分析。
2 结果
2.1 血清和关节液CCL5测定结果 RA和OA患者血清和关节液CCL5的测定结果见图1。对照RA患者血清CCL5水平与临床和实验室指标分析结果显示:血清CCL5水平与关节肿胀指数（r=0.3229，P<0.05），ESR（r=0.4001，P<0.05）和CRP（r=0.3735，P<0.01）呈显著正相关（图2，图3，图4），而与晨僵、握力、关节疼痛指数及RF相关性不明显。
图1 血清和关节液CCL5测定结果（略）
图2 RA患者血清CCL5水平与关节肿胀指数相关性分析结果（略）
图3 RA患者血清CCL5水平与ESR相关性分析结果（略）
2.2 外周血白细胞和滑液炎性细胞体外分泌CCL5的检测结果 上述结果显示，RA患者血清及滑液中CCL5水平增高，为探讨CCL5产生来源，本文对RA患者外周血白细胞和滑液炎性细胞产生CCL5的情况进行观察，结果显示:滑液炎性细胞产生CCL5较RA外周血白细胞和OA滑液炎性细胞产生CCL5高，而RA外周血白细胞产生CCL5与OA外周血白细胞无差异（图5）。
图4 RA患者血清CCL5水平与CRP相关性分析结果（略）
图5 培养液CCL5测定结果（略）
3 讨论
本文通过ELISA方法检测RA患者血清及滑液的CCL5水平，并与OA患者对照，结果发现RA患者血清和滑液中的CCL5水平均明显高于OA患者。且RA患者血清CCL5水平与患者的关节肿胀指数、ESR及CRP呈现显著正相关，提示CCL5参与RA的病变活动过程。
CCL5主要由T淋巴细胞产生，但最近的研究表明，大多数细胞都可表达CCL5，尤其在致炎细胞因子如IL-1β和TNF-α存在的情况下。在RA患者，我们观察到滑液CCL5水平显著高于血清，提示病变关节部位是CCL5产生的主要来源。对RA患者外周血白细胞和滑液炎性细胞体外产生CCL5的情况分析结果显示，RA患者滑液炎性白细胞产生的CCL5的水平明显高于OA患者滑液炎性细胞和RA患者外周血白细胞产生的CCL5的水平。尽管Robinson等 ［4］ 观察到CCL5mRNA在RA患者的外周血T细胞中表达增高，但本文未观察到RA患者外周血白细胞体外产生CCL5与OA患者有任何差异，此可能与RA患者外周血非T细胞CCL5mRNA表达下调 ［4］ ，因而使全血细胞产生CCL5水平无明显变化有关。Robinson等 ［4］ 对14例RA患者滑液炎性细胞中的T细胞和非T细胞表达CCL5mRNA进行对照分析，结果显示所有患者滑液T细胞表达CCL5mRNA增高，而仅有1例患者的滑液非T细胞CCL5mRNA表达增高。Hosaka等 ［5］ 对CCL5mRNA在RA患者滑液单核细胞和正常人外周血单核细胞中的表达进行了比较，结果发现二者无差异，说明滑液中T细胞是滑液炎性细胞产生CCL5的主要来源。OA患者滑液中虽有多量炎性细胞，但其滑液CCL5水平并无明显升高，且滑液炎性细胞体外产生CCL5的水平与外周血白细胞产生CCL5的水平比较差异也无显著性，此可能与OA患者滑液炎性细胞以单核为主，而T细胞极少有关。另一方面，CCL5的表达受到其他细胞因子的调节，致炎细胞因子IL-1β和TNF-α可诱导和刺激大多数细胞表达CCL5。而RA患者滑液中含有较高浓度的IL-1β和TNF-α ［6］ ，这也可能是RA炎性细胞产生CCL5增高的原因之一。
对RA患者滑膜组织进行免疫组化染色显示，滑膜浸润炎性细胞，间质细胞及滑膜衬细胞均呈现较强的CCL5免疫染色阳性反应，而在OA滑膜组织中仅有少许血管周围炎性细胞染色阳性。说明RA滑膜组织在产生CCL5中起重要作用。Volin ［7］ 和Konig ［8］ 等分别采用双重免疫染色和mRNA原位杂交技术检测CCL5在RA滑膜炎性细胞中的表达，他们发现表达CCL5的阳性细胞主要为CD68阳性巨噬细胞和CD3阳性T细胞。Robinson等 ［4］ 通过分离RA滑膜组织T细胞，对其表达CCL5mRNA的情况进行研究，结果也证实RA患者滑膜T细胞CCL5mRNA表达明显升高。
CCL5通过与靶细胞表面的CCR5结合，特异性趋化CCR5阳性白细胞亚群进入炎症部位。免疫病理研究结果显示，RA滑膜组织中的T细胞主要呈现Th1表型，而Th1细胞选择性在RA病变关节聚集，则可导致炎症迁延不愈。现已明确，Th1细胞特异性表达CCR5和CXC亚族趋化因子受体3（CXCR3），因而CCR5在介导Th1细胞向炎症部位的游走过程中起重要作用 ［9］ 。由本文的结果可以推测，在RA的发病过程中，RA患者的滑膜在不明致病因子作用下，产生CCR5的配体CCL5增多，从而趋化CCR5阳性T细胞（主要为Th1细胞）和单核细胞侵入病变关节部位。这些浸润滑膜或渗入滑液的炎性细胞进一步分泌更多的CCL5，驱使更多的炎性细胞侵入病变关节，这一恶性循环造成大量的CCR5阳性Th1细胞和巨噬细胞在关节聚集，使关节炎症经久不愈。因而，通过抑制CCL5的产生，减少炎性细胞在关节的浸润，可望阻断或延缓RA关节病变进展。对RA动物模型的研究结果已显示，用CCL5拮抗剂治疗，可预防或减轻关节炎的发生 ［10］ 。
参考文献
1 黄向阳，朱平.CC亚族趋化因子在类风湿关节炎的研究进展.中华风湿病杂志，2001，5（2）:119-122.
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3 Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，et al.The American Rheumatism Association1987revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum，1988，31:315-324.
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5 Hosaka S，Akahoshi T，Wada C，et al.Expression of the chemokine su-perfamily in rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol，1994，97:451-457.
6 Brennan FM，Maini RN，Feldmann M.Role of pro-inflammatory cy-tokines in rheumatoid arthritis.Springer Semin Immunopathol，1998，20:133-147.
7 VolinMV，ShahMR，Tokuhira M，et al.RANTES expression and contri-bution to monocyte chemotaxis in arthritis.Clin Immunol Im-munopathol，1998，89:44-53.
8 Konig A，Krenn V，Toksoy A，et al.Mig，GRO alpha and RANTES mes-senger RNA expression in lining layer，infiltrates and different leucocyte populations of synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis，psoriatic arthritis and osteoarthritis.Virchows Arch，2000，436:449-458.
9 Campbell JD，HayGlass KT.T cell chemokine receptor expression in hu-man Th1-and Th2-associated diseases.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2000，48:451-456.
10 Plater-Zyberk C，Hoogewerf AJ，Proudfoot AE，et al.Effect of a CC chemokine receptor antagonist on collagen induced arthritis in DBA/1mice.Immunol Lett，1997，57:117-120.
* 基金项目:四川省卫生厅科研基金资助项目（编号:610061）
作者单位:629000四川省遂宁市人民医院风湿科
637000四川南充川北医学院附属医院风湿科