乙肝无症状HBsAg携带者尿中HBVDNA含量及传染性的研究

　　【摘要】 目的  研究乙肝携带者尿液HBVDNA含量及传染性。 方法  将无症状HBsAg携带者首次晨尿经4.5万转/min（200000×g）连续超离12h浓缩至100倍，用32PHBVDNA探针检测HBVDNA，测算尿液HBVDNA含量，电镜下观察乙肝病毒形态结构。 结果  观察42例乙肝携带者，尿液检测HBVDNA阳性者14例，尿液HBVDNA阳性率为33.33%，尿液HB-VDNA含量最低值为35.50pg/ml，最高值为635.0pg/ml，95%的可信区间为13.42～590.13（pg/ml），HBVDNA平均含量为261.27pg/ml。电镜下看到管形及类Dane颗粒。 结论  乙肝无症状携带者尿液检出HBVDNA、观察到Dane颗粒，表明其尿液具有传染性，是构成对社会人群潜在的危险因素，在乙型肝炎接触传播中具重要的流行病学意义。提示，日常生活密切接触可能是乙型肝炎又一重要的传播途径。
     
     
　　The HBVDNA content in urine and infective research of person who carries HBsAg but have not symptom
     
　　Xi Zhaoyan，Hu Xingju，Liu Ling，et al.
   
　　Shanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Xian710054.
   
　　【Abstract】 Objective Studying the viral person whose HBVDNA in urine and infective.Methods There is the morning for the first time of person who carries HBsAg but no symptom，the urine passes4.50，000is transfered to/divided（200000×g）and exceeded concentrating to100times from now to12hours in succession.Measure HB-VDNA with32PHBVDNA probe.Calculate the urine HBVDNA content.Observe the viral B-mode hepatitis virus'shape structure under the electric microscope.Results Observing42viral persons who carries hepatitis B，the urine measures of14cases the positive one of HBVDNA，the urine HBVDNA positive rate is33.33%，the minimum value of the urine HBVDNA content is35.50pg/ml，maximum value is635.0pg/ml，HBVDNA average content is261.27pg/ml，95%confidence range is13.42～590.13（pg/ml）.Seeing small and spherical shape and one kind of Dane particles under the electric microscope.Conclusion The viral hepatitis B who carries but no symptom to exam-ine out HBVDNA in urine，observe Dane particle，indicate its urine is infective，form the dangerous factor potential to the social crowd，possess important epidemiology meanings while propagating at the viral hepatitis B.Brief on:it may be another important spread way of viral hepatitis B that daily life is kept in close touch.
   
　　【Key words】 urine carrier HBVDNA infective
      
　　病毒性肝炎已经成为严重的国际社会卫生问题，我国人群病毒性乙型肝炎感染率高达50%～60%，近年来，其中乙肝HBsAg阳性携带者在全国不少于一亿二千万人 ［1］ ，造成我国乙肝病毒感染率如此之高的因素目前尚不十分清楚。早期研究认为，乙型肝炎主要经输血、注射、针刺和母婴途径传播。但近年来通过流行病学调查及实验研究表明，有大量的人群并无输血、注射、针刺和母婴途径感染的历史。提示日常生活环境的接触传播可能是乙型肝炎的重要传播方式，然缺乏客观理论依据。国内外相继报道在乙型肝炎病人尿中查到乙型肝炎表面抗原（HBsAg） ［1，2］ 。彭氏曾对HBsAg携带者尿中HBsAg排出规律及流行病学意义进行初步研究 ［3］，为进一步确定尿液的传染性，阐明尿液污染物在乙型肝炎接触传播中的作用，我们采用32PHBVDNA分子杂交探针及电镜观察，对无症状HBsAg携带者尿中HBVDNA含量及传染性进行研究。
   
　　1 研究内容和方法
    
　　1.1 对象及标本处理 选择一农村肝炎研究观察点，用SPRIA法筛选HBsAg阳性无症状携带者，用洁净广口瓶收集清晨首次全部尿液，加0.1%NaN 3 防腐。取经联苯胺隐血实验阴性尿液30ml，经5000转/min冷冻低速离心30min，取上清液12ml移至U.S.A Beckman L5-50B超速离心机，经4.5万转/min（200000×g）持续离心12h，沉淀物用0.12ml上清液悬浮将标本浓缩100倍，置-20℃冰箱备检。
   
　　同时，静脉抽取血5ml分离血清置-20℃冰箱备检。用SPRIA法检测聚合人白蛋白受体（PHSA-Re）及HBVD-NA。
   
　　1.2 HBVDNA检测
   
　　1.2.1 HBVDN定性试验 采用32PHBVDNA探针进行斑点杂交。诊断试剂由北京大学肝病研究所提供，按照试剂盒说明要求进行试验。试剂比放射活性为1.2×10 8 cpm/μg。凡自显影斑点清晰、均匀致密者判为HBVDNA阳性。
   
　　1.2.2 HBVDNA定量试验 将克隆HBVDNA含标准定量的醋酸纤维素滤膜（由北京大学肝病研究所提供，含2-1000pg/40μl）与待杂交样品滤膜一同置入杂交液内，实行予杂交、杂交，并制备放射免疫自显影，用波长492nm光密度计分别测定不同HBVDNA含量的自显影斑点，记录OD值，用半对数格纸绘成标准曲线（见图1）。根据待检样品OD值可直接从曲线中查出HBVDNA含量（pg/40μl），再换算成pg/ml单位含量。见图1。
 
　　图1 HBVDNA含量标准曲线（略）
    
　　1.3 电镜检查 取经4.5万转/min（200000×g）超速离心浓缩100倍并经32PHBVDNA探针检测阳性的尿液1滴直接加于电镜铜网上，干燥固定后经磷钨酸负染，在JKm-100cx Ⅱ型透射电子显微镜53000倍下观察。

　　2 结果
    
　　2.1 尿液HBVDNA检出情况 从42例无症状HBsAg携带者的血清中检出HBVDNA阳性32例，检出率76.19%。尿中检出HBVDNA阳性者14例，检出率33.33%。尿液HB-VDNA阳性者其聚合白蛋白受体（PHSA-Re）及血清HBVD-NA均为阳性，见图2。
 
　　图2 乙型肝炎HBsAg携带者尿液HBVDNA放免自显影照片（略）
    
　　2.2 尿液HBVDNA含量 检测14例尿液HBVDNA含量，其最低值为35.50pg/ml，最高值为635.0pg/ml，尿液HBVDNA平均含量为261.27pg/ml，较血清含量为低。见表1。
    
　　表1 乙肝HBsAg携带者血及尿中HBVDNA含量比较（略）
      
　　注:t=2.24，P<0.05
    
　　2.3 尿液电镜观察 对5份尿液HBVDNA阳性标本经直接电镜观察，有2份在电镜下查及小球形、管形及类Dane颗粒。见图3。
 
　　图3 电子显微镜下观察的乙肝病毒形态学照片小球形、管形、类丹氏颗粒
   
　　3 讨论
    
　　我国属乙型肝炎感染的高流行区，人群乙肝感染率约为60%，地处内陆的陕西省人群感染率虽低于全国水准，然亦超过50% ［1］ 。人群乙型肝炎病毒如此之高的感染率，很难由过去公认的经血液、注射、针刺、母婴等传播途径予以解释。本研究旨在从分子生物学角度探讨借日常生活接触传播乙型肝炎的可能，特别是乙型肝炎携带者尿液的传染性。
   
　　3.1 关于尿液HBVDNA 尿液属人体排泄物，对外环境污染较为广泛。近年，国内外学者相继报道在HBsAg阳性者尿液中查到HBsAg ［2～4］ ，提示通过HBsAg阳性尿液污染环境，借日常生活接触传播乙肝的可能性。但HBsAg系乙肝病毒（HBV）的外壳，因不含核糖核酸成分，故本身不具传染性。因此，要证实尿液传染性并评价其流行病学意义，尚需直接从尿液查到乙肝病毒复制所依赖的HBVDNA。
   
　　1985年，非洲Dibisceglic氏等首次报道 ［5］ ，在6例HBsAg及HBeAg阳性携带者的尿液中查到1例HBVDNA阳性，该例血清HBVDNA为中等水平，DNA多聚酶浓度为267cpm。据此，本中心开始探索中国人群乙肝病毒携带者尿液HBVDNA动态及其传染性，在没有研究方法的情况下我们采用差速离心法将尿液浓缩100倍，用32PHBVDNA探针在42例携带者尿液中检出HBVDNA阳性14例，尿液HBVDNA阳性率高达33.33%。同时，尿液HBVDNA阳性者其聚合人血清白蛋白受体（PHSA-Re）及血清HBVDNA皆为阳性。表明在血清PHSA-Re和HBVDNA阳性的HBsAg携带者尿液中可排出HBVDNA。本次研究尿液中乙肝病毒HBVDNBA较高检出率的结果，直接提供了携带者尿液具有传染性的客观证据。
   
　　3.2 关于尿液Dane颗粒 对HBVDNA阳性的尿液标本，在电子显微镜下直接观察到乙型肝炎病毒抗原:小球形、管形及类Dane颗粒，而Dane颗粒是乙型肝炎完整的病毒，具有完备的病毒核酸结构，是乙型肝炎具有病毒复制和传染性的根本性标志。同时，在外界环境中存活时间较长，一般消毒剂也不易被杀灭。当其污染环境，即可造成接触感染和传播乙型肝炎的可能。
   
　　3.3 关于尿液HBVDNA含量及传播乙肝的程度 HBVD-NA是反映乙型肝炎病毒（HBV）复制状态及感染性的关键指标。西德著名肝炎专家Hubert EB氏指出 ［6］ :“血清中含0.01ng/ml（10pg/ml）的HBVDNA可使猩猩感染”。我们测定无症状HBsAg携带者中HBVDNA最低含量为35.50pg/ml，最高含量达635.0pg/ml，平均含量为261.27pg/ml，95%的可信区间为13.42～590.13（pg/ml）。虽较血清HBVDNA为低（血清平均含量为753.11pg/ml），但远高于猩猩感染剂量。根据乙肝病毒受染剂量测算，尿液HBVDNA含量的95%的可信区间值均大于可感染剂量，尤其是尿液HBVDNA平均含量达到可感染剂量的26倍之多。由此可见，乙肝病毒携带者尿液的传染性非同寻常，其可传染程度亦相当之高。
   
　　美国学者研究认为:HBV携带者在传播HBV的流行病学方面占有中心位置，HBV可通过皮肤和黏膜途径传播，任何一个HBsAg阳性的人均有潜在的传染性 ［7］ 。据此，对于乙肝携带者尿液HBsAg阳性，特别是尿液HBVDNA阳性，无疑具有环境污染的感染性和广阔范围的传染性。
   
　　以上研究表明:无症状HBsAg携带者的尿液具有传染性，是构成对社会人群潜在的危险因素，在病毒性乙型肝炎接触传播中具有十分重要的流行病学意义。日常生活接触传播可能是目前乙型肝炎继血液、母婴传播之外又一重要的传播途径。
     
　　参考文献
    
　　1 戴志澄，祁国明.中国病毒性肝炎.北京:北京科学技术出版社，1997，39.
   
　　2 Apostolov K.Australia antigen in urine.Lancet，1971，1:1274.
   
　　3 蔡来舟.98份尿中HBsAg检测情况的报告.中华流行病学杂志，1986，（7）4:208.
  
　　4 彭有源.尿中HBsAg检出及流行病学意义的初步研究.中国公共卫生，1987，6（2）:90.
   
　　5 Dibisceglic R.Detection of markers of hepatitis B virus infection in urine of chronie carriers.J Med Virol，1985，16.337.
   
　　6 Huburt EB，乙型肝炎病毒分子生物学研究进展.赴河南讲学资料汇编，1985.
   
　　7 防治病毒性肝炎的建议.（Recommendations for Protection Against Viral Hepatitis）美国医学会杂志中文版，1986，5（1）.
    
　　作者单位:710054陕西省疾病预防控制中心