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2 雷藤氯内酯醇(T4)对睾丸的影响
睾丸是男性生殖器官的主性器官,主要有两大生理功能:即精子的发生和雄性激素的合成。抗生育剂量的雷藤氯内酯醇对睾丸生精上皮形态无明显改变,细胞组合及细胞期相关系正常,各级生精细胞、支持细胞和间质细胞的形态和染色反应均属正常范围,主要作用于晚期精子细胞的变形,核蛋白的转化及延缓精子排放,表现为曲细精管精子发生过程受到不同程度的干扰,出现生精作用的动力学紊乱。动物实验提示,T4对睾丸的生精细胞、间质细胞的作用不显著,而对支持细胞的作用未见报道,还有待进一步的研究。
2.1 T4对生殖细胞染色体的影响 通过对T4实验组雄性大鼠精母细胞减数分裂的观察,所看到的偶线期及粗线期联会复合体的图像均正常,表明T4对生殖细胞染色体及其配对行为无影响。T4组的精原细胞有丝分裂图像,与对照组相同,未见染色体畸变或其它损伤。T4不引起精子头部形态的改变 [10] 。
2.2 T4对睾丸生精细胞影响 据药物实验报道,T4实验组睾丸的曲细精管精子发生过程受到不同程度的干扰,为Ⅸ、Ⅹ期曲细精管腔缘均可见到未排放的残存精子,表明T4有延迟精子排放作用,还可见碱性核蛋白的转换和替代过程受到抑制的图像,另观察到睾丸曲细精管圆形精子细胞向长形精子转变过程受阻,最终产生圆形头部的精子,提示T4对睾丸生精作用有影响 [18] 。T4实验组睾丸曲细精管的结构,包括生精上皮的细胞排列,各级生精细胞、支持细胞和间质细胞的形态和染色反应与对照组无显著差异,T4组对睾丸生精细胞无影响 [21] 。也有人报道,T4能使小鼠睾丸曲细精管萎缩,曲细精管内各级生精细胞严重缺失,认为T4选择性的作用于后期生精细胞 [3] 。
2.3 T4对睾丸间质细胞的影响 在动物体内实验,T4实验组与对照组血浆中睾酮没有明显的差异,但在离体培养的环境下,T4组的睾丸间质细胞分泌睾酮的量明显下降,提示T4对睾丸间质细胞有一定的抑制作用 [19] 。T4对睾丸间质细胞的影响还须深入的研究。
2.4 T4对睾丸透明质酸酶活力的影响 T4短期灌服大鼠,其睾丸透明质酸酶活力无明显影响,但喂服的时间延长后则出现睾丸的透明质酸酶活力受抑制作用,而透明质酸酶在精子受精过程中起重要作用,这可能是T4抗生育作用的机理之一 [22,23] 。
2.5 T4对睾丸谷胱甘肽、H 2 O 2 和脂质过氧化的影响 T4对睾丸谷胱甘肽含量无明显影响,T4在体外对睾丸微粒体H 2 O 2 的生成无明显作用,也不影响睾丸匀浆MDA的含量,提示T4对睾丸的脂质过氧化作用无影响。
3 雷藤氯内酯醇(T4)对附睾及附睾精子的影响
附睾是精子运行的管道和储存的场所,也是精子成熟的主要器官。精子在附睾内的成熟过程,包括获得运动及自然受精的能力,实验研究显示精子的成熟主要发生于附睾的近段,在此过程中,涉及到精子发生一系列生理、生化及一些形态改变。附睾上皮通过分泌和吸收功能实现内环境的恒定。雷藤氯内酯醇通过作用于附睾上皮,影响其分泌和吸收功能,改变其内环境,阻止精子成熟,同时也直接作用于附睾精子,干扰其正常的成熟过程。其确切的作用机制需要进一步证明。
3.1 T4对附睾形态的影响 T4组附睾上皮高度及RNA分布相比,基膜的PAS和ALP与对照组相同,上皮细胞的SDH和LDH沉淀比对照组稍粗,T4不影响附睾上皮高度及基膜的AP活性,提示对性激素的释放及作用无影响。T4对附睾的影响最为明显,并可使附睾重量显著降低,不影响睾丸重量 [21] 。
3.2 T4对附睾分泌功能的影响 T4组的附睾液中的肉毒碱和α-糖苷酶含量均比对照组显著降低,但附睾头部匀浆的上清液中α-糖苷酶以及酸性磷酸酶活性无变化,T4并不作用于生精细胞的供能环节,T4通过抑制附睾上皮分泌功能进而影响附睾内液环境阻碍精子成熟,使附睾精子全部停止活动影响受精能力,导致不育,这可能是其抗生育的主要机制 [24] 。
3.3 T4对附睾透明质酸酶和谷胱甘肽的影响 T4对附睾透明质酸酶活力有抑制作用,且能使谷胱甘肽含量下降,从而影响附睾精子的受精能力和脂质过氧化作用。
3.4 T4对附睾精子的影响 T4对附睾尾精子影响比较明显,并与雷公藤多甙作用相似 [25] ,但不导致精子头部畸形,而是引起精子颈体弯曲,达到一定程度后出现头尾分离,可能是雷公藤单体T4直接作用于精子骨架系统进而累及线粒体鞘的结构与功能所致 [26] 。对附睾尾精子涂片组织化学反应证明精子线粒体损伤程度与服药时间和剂量成正相关,短期喂药精子线粒体鞘LDH、ICDH、MDH、SDH反应活性减弱,随着喂药时间延长,酶反应沉淀颗粒减少且变粗 [21] 。
3.5 T4对精子核蛋白组型的影响 大鼠口服T4抗生育剂量(50μg·kg -1 ·d -1 )7周后,能使精子核中总碱性蛋白(TNBP)含量下降,总组蛋白(TH)/精核蛋白(Protamine)比值升高,精核蛋白含量下降,T4使精子细胞核蛋白组型转换受阻是导致大鼠不育的重要原因之一 [27,28] 。
4 雷藤氯内酯醇(T4)对人精子的影响
在体外实验中,T4有致人精子失活而不育的药理作用,并影响精卵受精。T4抑制人射出精子的钙离子内流,导致精子膜内外钙离子梯度浓度失去动态平衡,可能是T4抑制精子活力的重要机理之一。但T4不影响离体大鼠胸主动脉和输精管的收缩,可能有选择性的作用在附睾部位 [29] 。根据其他报道,T4对人、大鼠精子的直接作用,可观察到顶体酶被抑制现象,表现为顶体酶溶解明胶的光圈变小或消失,从而可能影响精子的受精能力 [30,31] 。
5 雷藤氯内酯醇(T4)的生殖毒性研究
5.1 T4对停药后恢复生育的影响 灌服T4抗生育剂量的雄鼠,用药8周后生育力降至零,但性行为存在。在停药后5周,观察到其睾丸组织结构和附睾精子均恢复正常,雌鼠交配后产生正常仔鼠 [18,30] 。
5.2 T4对子代的影响 大、小鼠灌服T4抗生育剂量8周后停药,与正常雌鼠进行交配。结果表明,T4停药后5~6周,大、小鼠全部恢复生育能力,与其交配的雌鼠生下健康正常的子代,检查仔鼠的内脏器官和运动反射均正常,与对照组相比,无明显差异。
5.3 T4对围产期小鼠的影响 妊娠雌鼠按T4大剂量组(0.6mg·kg -1 ·d -1 )、小剂量组(0.3mg·kg -1 ·d -1 ),于妊娠第15天给药,至分娩后停药。结果表明,怀孕母鼠生育时间正常,生育胎数正常,仔鼠运动行为反射正常;病理检查显示心、肝、肾、脾、性腺、垂体组织结构正常,仔鼠发育良好,未见异常行为及畸形。仔鼠性发育成熟后,再进行组内交配,结果子一代雌鼠均能正常怀孕,所生出子二代仔鼠外观正常。表明子代雌、雄鼠生殖功能正常。胎鼠畸形学检查表明,整体切片观察无内脏畸形,茜素红染骨骼无异常发育,这说明T4不具有胎毒作用[30] 。
6 雷藤氯内酯醇(T4)对主要脏器的影响
6.1 T4对肝脏的影响 在对T4的毒副作用研究中 [32] ,T4对大鼠肝功能无影响,对肝H 2 O 2 生成、脂质过氧化和谷胱甘肽均无影响,对肝脏无明显损害。
6.2 T4对肾脏的影响 T4对肾脏功能无影响,血BUN水平无变化,肾近曲小管刷状缘碱性磷酸酶(ALP)活性和对照组相似,不影响近曲小管的重吸收功能。
6.3 T4对其它器官的影响 T4对心、脾没有明显的损伤作用,对血糖、血清皮质醇水平均无影响。
7 小结
男性抗生育药物的研究已有30多年的历史,至今在临床上尚无实际可用的男性避孕药物。目前男性避孕药物的研究重点以激素类药物为主,而非激素类药物,尤其是从雷公藤中提取的二萜类环氧化合物系列也颇引人注目 [33,34] 。理论上,雷藤氯内酯醇(T4)作用于精母细胞致不育时间为用药后第6~7周,作用于精子细胞应为3~5周,而作用于附睾则起效时间在2周以下 [35] 。T4作用的主要环节可能对附睾精子及变态期精子细胞产生显著影响,而睾丸内精子发生正常,表现为附睾中贮积大量不活动精子,附睾管腔内精子密度降低,并可见脱落的精子细胞,大多数精子头尾分离和颈部弯曲,精子头部未见畸形,提示T4作用环节理想。但由于中药作用机理比较复杂,还不清楚其靶分子的确切部位(支持细胞、附睾上皮、生精细胞及精子),有待于进一步的研究和探讨。另外,药物所致病变出现的先后与轻重,与用药总量、时间长短有依赖关系,长期使用对遗传效应的影响不确切,我们需慎重考虑药物开发利用的安全性。雷藤氯内酯醇(T4)在发挥抗生育作用的有效剂量下对机体的毒副作用小,不影响性欲且作用可逆,作用部位理想。因此,雷藤氯内酯醇(T4)单体可能更适合于雄性抗生育制剂被开发利用。故有必要对T4的抗生殖作用的有效性及安全性做进一步的研究,提高其安全性和应用价值,为雷公藤的进一步开发利用奠定基础,以期研制出安全、稳定、可接受的男性避孕药。
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作者单位:430030湖北武汉华中科技大学附属同济医院生殖中心(△ 通讯作者)