中草药中活性成分的筛选

　　【摘要】  中草药中活性成分的筛选，是寻找对特定药靶有生物活性的小分子化合物的重要途径，对解释中草药的作用机制也有重要意义。本文概述了在中草药活性成分的筛选过程中提取物库的建设、筛选方法和活性物质的生物活性导向分离等基本方法。
       
    
　　Identification of bioactive compounds from Chinese herbal medicines
     
　　Zhao Yelian，Fan Hui，Gao Hong，et al.
   
　　Chemistry Education Laboratory，Fifth Middle School of Huaihua City，Huaihua418000.
   
　　【Abstract】 Screen of bioactive compounds from Chinese traditional medicines is an important method that not only can identify bioactive small molecular compounds specific for drug targets but also can explain the functional mechanism of treating diseases using Chinese traditional medicines.The process of identifying bioactive compounds from Chinese herbal medicines is described in this paper，including the basic methods such as compounds library es-tablishment，screen methods and bioassay guided isolation.
   
　　【Key words】 Chinese herbal medicines drug screening bioactive ingredient
      
　　动植物中含有丰富的次级代谢物，其中许多有生物活性，中国有几千年的中草药研究和应用历史，中药是我国宝贵的自然资源。但是，许多中草药的作用机制不明确，活性成分不清楚。其中的有效成分及其作用的分子机制或作用的靶点是当代中药研究的热点之一，这方面的研究将为中药现代化起着非常重要的推动作用。
   
　　我国丰富的中医治病防病的理论和中草药功效的信息资源，对我们从中草药中筛选作用于特定药靶的活性成分，开发新药，解析中药的作用的分子机制，都具有非常重要的指导意义。根据药靶的功能和中草药的功效，挑选适当的中草药，从中药中筛选有效成分，将大大增加筛选的成功几率，降低筛选成本。分子生物学和细胞生物学技术的发展，使我们以高通量形式从中草药中寻找对特定药靶有生物活性的成分成为了可能，然而，在这方面我国还刚刚起步。
   
　　在进行中草药活性物质筛选前，需要建立中草药提取物库;利用现代分子生物学和细胞生物学技术，建立基于特定药靶的药物筛选方法;筛选后，再对有活性的提取物进行生物活性导向分离，找到有活性的单一的小分子化合物，为药物的进一步开发和解析中草药作用的分子机制奠定基础。
    
　　1 中草药提取物库的建设
    
　　国外许多公司也非常看好中草药有效成分的筛选，国内还有专门为国外公司提供天然提取物的单位。植物的次级代谢物在植物体内很多，有的多达700多种，其中许多是有生物活性的，这是一个巨大的化合物来源。
   
　　药物筛选离不开化合物库，天然提取物库是重要的化合物来源。可以将天然化合物库分成以下三种情况:（1）粗提物库，（2）初步分离物库，（3）:精分离物库（图1）。
 
　　图1 天然提取物库的建立（略）
    
　　粗提物库可以通过水提或醇提得到，中药作为汤剂，服用的都是水提物，水提物基本上能提供多数有效成分。当然，水提是有缺陷的，一些不溶于水的化合物可能在水中的溶解度小，不易提出，而且水提时可能提出较多的多糖（如:淀粉）、蛋白质和鞣质等，它们往往是没有活性的，但水提方法简单、经济。醇提时可以用乙醇或乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂进行提取，提出的化合物较多，但水溶性的化合物相对水提要差一些，而且醇提花费大。粗提物也可以直接用于药物的筛选，用这种粗提物也能筛选到对某些药靶有活性的物质，说明中草药粗提取物基本上适合药物筛选 ［1～4］ 。当然，粗提取物用于药物筛选其缺点也是明显的，因为许多化合物混合在一起，相互之间可能有干扰，也可能会因为有效成分含量少而难以验出。但是这种方法建立的提取物库简单、成本低，而且大多数情况下能获得理想的结果，是简单条件下做药物筛选的好方法。
   
　　粗提取物经初步分离可以建立一个比较经济的初步分离物库。经粗提后，用不同极性的溶剂再经过柱层析，得到不同极性溶剂洗脱下的提取物组分，分发到96孔板中保存，建成经济型的天然提取物库。初步分离有利于活性成分的富集和活性检测。初步分离库有明显的优点，除了能有效地富集有效成分外，在同一个组分中，化合物的数目减小，相互干扰减小。与粗提取物库相比，虽然这种方法提高了建库的成本，但是能提高筛选的效率。提高成本也是值得的。
     
　　精分离库是在初步分离的基础上，再通过高效液相色谱（HPLC）进行进一步的分离，然后将分离后的组分分发到96孔板中，使每个孔中的化合物数目在5到8个左右 ［5］ ，这样建成的库，用于筛选时，化合物的干扰更小，但是，建成这样的库，要比经济库成本要高出2倍以上，而且筛选时的花费也要提高好几倍。多个化合物放在一起进行药物筛选，能大大降低成本。采用什么样的库，建什么样的库，应根据自身的条件和要求进行选择。 

　　2 天然提取物的药物筛选
    
　　中国有几千年使用中草药的历史，有着丰富的治病与药效的信息资源，因此根据药靶—疾病—中药的相互关系，查阅各种资料，有针对性地选取适当的中草药提取物进行筛选，有较高的成功率，而且可以降低筛选的通量 ［1～4］ 。即使是条件不太好的实验室，也能进行这种低通量的筛选，得到满意的结果。
   
　　药物筛选的方法有许多，基本上可分为三种类型:基于细胞的、基于溶液的和基于微球的等方法。这些方法应适合高通量的要求，即:微量、快速、灵敏和适合机器自动化操作。而基于动物模型的方法不太适合大量筛选的要求，但可用于进一步的生物活性验证。
   
　　如果是基于细胞的药物筛选，就需要考虑提取物的使用浓度，因浓度大时，会对细胞产生毒性 ［1，2］ 。因此，筛选前对提取物进行总浓度的标准化是非常必要的，筛选时，选取一个适当的浓度，使其在大多数测定中，这种浓度对细胞没有毒性。
   
　　基于荧光的筛选，需要考虑因提取物的荧光带来的假阳性，天然提取中，有一些成分可能是有荧光的。因此，方法设计时，必需考虑如何排除假阳性。或者采用适当的筛选方法，例如采用均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF）可以克服这种情况。
    
　　3 天然化合物的生物活性导向分离（Bioassay guided isola-tion）
      
　　筛选前，虽然不必将所有的化合物进行分离，但是，筛选后面临的主要问题是如何将活性成分分离出来。生物活性测定导向分离，是天然产物药物筛选后，活性成分分离的必不可少的技术。它基于可靠的生物活性测试方法，一步一步从天然提取物的混合物中分离出有生物活性纯物质。这种方法与有目的性的分离某种类型的化合物不同，分离前，研究者无法预知活性提取物中有效成分的类型。往往几乎没有可以直接参考的文献资料，只能以前人的工作总结、间接的文献资料、个人的观察和积累的经验做指导，通过不断摸索。因此，活性物质分离是一项非常艰巨的工作。
   
　　总的来说，生物活性测定导向分离可以分为以下几个步骤:（1）样品的前处理，（2）活性成分的提取与初步分离，（3）柱层析、薄层层析分离和高效液相色谱分离等，在每一步分离后，都要进行生物活性测定，直到分离出有活性的单一的小分子化合物为止。
   
　　3.1 样品的前处理 提取前，需要进行样品处理。如果样品是干品，可直接将其粉碎，如果是新鲜的动物组织或昆虫，可以在液氮中粉碎，然后再进行提取。
   
　　3.2 提取 在生物活性导向分离前，选择适当的提取方法，对有效分离活性成分是非常重要的。不适当的提取方法，可能会为以后的分离带来困难。基本要求是，所选择的提取方法应当能使提取物中活性成分的量最大，而非活性成分尽可能少。
   
　　不同样品的提取方法可能不同，在提取过程中，使用的溶剂要根据需要去选择。没有通用的方法可供选择，主要靠不断实验摸索和操作者的经验。
   
　　可考虑用各种不同极性的溶剂，从低极性向高极性进行选择。非极性溶剂，如:石油醚，还可以除去样品中的油脂，因此先用石油醚提取，能为后续分离创造更好的条件 ［6］ 。最初，可以采用系统溶剂依次提取，采用索氏提取器，用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙脂、丙酮、甲醇进行提取，检测各组份的活性。这种方法还可以估计活性成分可能的类型。亦可将药粉先用水或醇提取，提取液浓缩成浸膏，浸膏用上述溶剂依次提取。但浸膏常常为胶状物，难于分散在低极性溶剂中，可拌入适量填充剂如硅藻土等，低温干燥，使成粉末，这样提取就比较完全。在更换新溶剂前，应将原溶剂挥发除尽。
   
　　也可以采用热水或醇提取，减压浓缩，然后用不同极性的溶剂，从低极性到高极性，依次萃取 ［7］ 。然后，对各个提取物进行活性测定。直接水提可能会提出多糖、蛋白质、鞣质等一些溶于水的高分子，如果不先沉淀出这些物质，往往会在有机溶剂萃取时，产生乳化作用，不容易分层。此时可以将其浓缩到一定体积，加入乙醇沉淀出这些物质。浓缩后，用不同的溶剂，极性从低到高，依次萃取。检测萃取物的活性，活性组份进行下一步纯化。
   
　　也可以将初提物溶解到一定浓度的甲醇水溶液中（甲醇水溶液的浓度常为60%），然后用低极性的溶剂（如:正己烷）进行萃取，逐步增加水的比例和溶剂的极性，依次萃取，检测萃取物的活性，活性组分再进一步的纯化 ［8，9］ 。
   
　　3.3 层析分离 提取后，用柱层析进行分离纯化，是常用的方法。不要寄希望在一次柱层析时能将活性成分分离出来，除非运气好，因为天然提取物中的组分太多。首先，用薄层层析选好溶剂体系。然后，在柱层析时，采用低极性溶剂和高极性溶剂的混合溶剂，选取某个比例的起始和终止，从低极性溶剂到高极进行梯度洗脱。最后，对每个组分进行活性测定，将活性成分进行下一轮柱层析，直到找到有活性的成分为止。
   
　　柱层析后，如果得到的组分还是一个混合物，如果此时样品的量很小，再用柱层析分离，会造成较大的损失。此时，可用制备薄层层析的方法可分离 ［8］ 。方法是将样品在薄板上点成线，层析后，将条带括下，用溶剂洗下来，挥发掉溶剂即可。
   
　　通过柱层析和制备薄层层析后，可能得到单一的有生物活性的小分子化合物。要得到更纯的，还要进行HPLC 分离。
    
　　4 结束语
    
　　从中草药中筛选作用于特定药靶的药物，不但可以找到中草药中的有效成分，同时也可以解释中草药治病的部分分子机制，对中药现代化的研究具有重要意义，也是开发新药的重要手段。筛选天然药物深受国际上许多制药公司的重视，虽然我国在中草药方面有得天独厚的资源，但是对中草药的资源利用得还不够，还只停留在传统模式上，我们要有一种紧迫感，否则，中国的中药会只剩下药材的外壳，里面的有效成分会被国外专利所掏空。
    
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　　作者单位:418000湖南省怀化市第五中学化学教研室
   
　　　　　　　200062上海华东师范大学脑功能基因组学研究所（ *通讯作者）