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关键词 琼脂糖凝胶电泳 酶偶联法 全自动电泳仪
Establishment of a method of using coupled glutamate
dehydrogenase to detect aspartate aminotransferase isoenzymes
Mi Qingmei，Cao Luning
Shanghai Chang-zheng Hospital，Shanghai200003.
【Abstract】 Objective To establish a method of using coupled glutamate dehydrogenase（AST，EC2.6.1.1）to detect aspartate aminotransferase isoenzymes in human serum.Methods The serum was electrophoresed for15min at36mA with65mmol/L diethylbarbital buffer（pH8.6）and10g/L agarose gel in Helena SAS1+2auto-elecˉtrophoresis apparatus and incubated it for30min at37℃in2ml H 2 O containing the substrate stain.Results The substrate with GDH activities exceeded258U/L can obtained the better result.50samples ASTm of hepatocarcinoma patiens was ranged14.8to132.2U/L.30samples ASTm of acute hepatitis patients was ranged25.5to310.7U/L.20samples ASTm of myocardial infarction patients was ranged20.8to146.7U/L.ConclusionMammalian aspartate aminotransferase isoenzymes（electrophoresed）exist in two predominant forms，one mitochondrial（ASTm），the other of soluble or cytosolic origin（ASTs）.The method of using coupled glutamate dehydrogenase to detect aspartate aminoˉtransferase isoenzymes was convenient and sensitive in Helena SAS1+2auto-electrophresis apparatus.The ASTm assay in human serum showed that significant clinical information，especially on the severity extent of liver diseases and myocardial infarcton.It may be useful in the diagnosis of liver cell damage of the patient.
Key words agarose electrophoresis enzyme coupling auto electrophoresis apparatus
天冬氨酸氨基转移酶（AST，EC2.6.1.1）在人血清中有两种同工酶，一种称为ASTs，存在于细胞浆内，另一种称为ASTm，存在于细胞线粒体内。ASTs、ASTm由于分子结构不同，电泳时可分离出两条不同的区带。在碱性溶液中，ASTs向阳极移动，ASTm向阴极移动。正常人血清中ASTm含量甚微，它的升高主要见于心肌及肝脏实质细胞受到严重损害。本研究将自制琼脂糖凝胶板应用在SAS1+2全自动电泳仪上，利用酶（GDH）偶联显法染色，可快速、简便地把AST两种同工酶检测出来，本文就各种实验条件在SEBIA全自动电泳仪上作了摸索，选择。原理:α-酮戊二酸+L-天冬氨酸 AST L-谷氨酸+草酰乙酸 L-谷氨酸+NAD + +H 2 O GDH α-酮戊二酸+NADH+NH 4+NADH+PMS→NAD + +PMSHPMSH+NBT→PMS+甲 月替 （紫蓝色）
1 材料和方法
1.1 材料 （1）主要仪器:SAS1+2全自动电泳仪（美国Helena公司）。（2）主要试剂:巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，I=0.05）充注电极膜条。混合缓冲液（pH7.5）:咪唑567.5mg，EDTA162mg，硼酸68.7mg，巴比妥钠458.7mg，二氨基二甲基1、3-丙二醇909mg，加水溶解，氢氧化钠调pH为7.5，加蒸溜水至500ml。1%琼脂糖溶于混合缓冲液中，加热，制板，4℃冰箱保存。基质、显色液:Tris缓冲液80mmol/L，α-酮戊二酸12mmol/L，L-天冬氨酸200mmol/L，GDH258U/L，加热溶解，冷却后用HCl调pH至7.5。再加入磷酸吡哆醛0.1mmol/L，ADP21.2mmol/L，NAD + 67.8mmol/L，NBT2.5mmol/L，PMS0.15mmol/L（用前新配制）。
1.2 方法 （1）取琼脂糖凝胶1支，加热溶解，制成10cm×7cm×0.1cm的凝胶板，冷却后，在板中央处铺一加样膜，加样后静置片刻，移去加样膜，将凝胶板放入SAS1+2全自动电泳仪电泳区域，在两侧放入两条电泳膜条。电泳:电压150V，电流36mA，时间15min。（2）基质孵育、显色:电泳完毕，加基质液3ml于琼脂糖凝胶板上，37℃孵育、显色20min。（3）漂洗:加0.5%冰醋酸水溶液5ml于琼脂糖凝胶板上，5min，漂洗凝胶板，使凝胶板底板清晰，便于扫描。（4）扫描:用Helena扫描仪570nm波长直接扫描定量分析。若凝胶板放置室温25℃15h干燥，可长期保存进行、操作、测定。
2 结果
（1）血清用量:分别用3μl、5μl、8μl血清量加样后进行电泳，比较结果显示血清量为5μl最适宜，（2）8μl易使电泳区带弥散。（3）琼脂糖凝胶板缓冲液选择:用巴比妥-巴比妥钠缓冲液亦可，但通过电泳后结果表明，两条电泳区带弥散，不紧密，影响扫描灵敏度。改用混合缓冲液（pH7.5）后，两条电泳区带分离清晰、紧密，便于扫描。（4）电压选择:电压分别为100V、150V、200V时测定结果表明，在100V电压时，达到ASTs、ASTm最好分离效果为20min，电泳过程中产热不多;在150V电压时，最好分离效果为15min，电泳过程中稍产热;在200V电压时，最好分离效果为10min，电泳过程中产热现象严重，使AST酶部分失活。因此，本文选择电泳最佳条件电压为150V，时间15min。（5）基质液孵育时间选择:分别作基质液孵育、显色15min、30min测定，其结果经Helena扫描仪扫描，基本一致。（6）重复性测定:人心肌、肝脏组织取自一名猝死男性，27岁，生前身体健康。取心肌、肝脏组织各1.0g，分别加入KH 2 PO 4 ·Na 2 HPO 4 缓冲液pH7.05ml，冷冻匀浆，冷冻离心，取上清，做重复性测定。结果为人心肌组织20次总AST为5700U/L，其ASTs为1240.9～3203.4U/L，ASTm为348.3～2285.7U/L，人肝脏组织20次总AST为8200U/L，其ASTs为1943.2～4590.3U/L，ASTm为769.6～6532.1U/L。见图1。
图1 人心肌组织（1、2）和肝脏组织（3、4）的匀浆电泳图型
表1 人心肌组织（1、2）和肝脏组织（3、4）的匀浆电泳扫描结果 （%）
（7）线性范围测定:取人心肌匀浆分别做10倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍稀释，得结果见图2。图2分别稀释做线性测定
表2 人心肌匀浆分别稀释作线性测定扫描结果 （略）
（8）病例结果:我们测定了20例心肌梗死病人，其ASTm范围为20.8～146.7U/L，ASTs/ASTm的比值为5.39～28.4，50例肝癌病人，其ASTm范围为14.8～132.2U/L，ASTs/ASTm的比值为4.9～23.6，30例急性肝炎病人，其ASTm范围为25.5～310.7U/L，ASTs/ASTm的比值为37.3～44.6。我们还检测到了2例肌营养不良患者，其AST总活力很高，平均达1056U/L，其ASTm为21.3U/L，ASTs/ASTm的比值为502.9。
3 讨论
血清AST同工酶测定方法有免疫法 ［1］ 、柱层析法 ［2］ 、琼脂糖凝胶电泳法 ［3］ 。免疫法 ［4］ 比较准确，但需免疫动物，试剂来源不易。琼脂糖凝胶电泳法比较简单，通过扫描仪，可做定量测定。
有报道 ［3］ AST同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定ASTs和ASTm，但其制作过程复杂，而且显色的同时也使凝胶板底色显蓝色，与真正的ASTs、ASTm同工酶区带混淆。本文介绍的简易琼脂糖凝胶电泳快速法，在10cm×7cm×0.1cm的凝胶板上，同时测定7例病人的ASTs和ASTm结果，实验室备有水浴箱、电泳仪、电泳槽、扫描仪即可。
本文经过在SAS1+2全自动电泳仪上的血清用量、琼脂糖凝胶板缓冲液、电压等条件的摸索选择，得出最佳条件为:电泳电压150V，时间15min，孵育、显色20min，波长570nm扫描得结果，方法快速、简便。
正常人血清琼脂糖凝胶电泳只