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蛋白尿是肾病患者常见的重要临床表现之一。尿液中蛋白定量分析对于肾脏病变的诊断、治疗及预后有着一定的意义 ［1］ 。24h尿蛋白定量是肾病患者不可缺少的检查之一 ［2］ 。双缩脲法测定蛋白质具有稳定、可靠、重复性好等优点，是可信的实验室方法 ［3，4］ ，一般用于某些需精确观察尿蛋白排出量情况的研究，临床常规中并不普及。另外，尿蛋白检测过程中有时会受到尿液中诸如盐类结晶、药物代谢产物、尿液中色素等因素的影响。本实验室在临床尿液标本的检测中发现部分24h尿蛋白定量检测结果与临床表现不符。通过将检测尿蛋白的实验步骤具体化，建立准确可靠的24h尿蛋白检测方法，使检测结果能够更好地反应患者的病情，支持肾脏病的临床诊断与治疗。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 蛋白标准液（73g/L）由南京军区南京总医院全军临床检验中心提供。实验中所用的试剂均为分析纯，具体浓度见操作步骤。
1.1.2 仪器 分光光度计（722RS型，上海分析仪器厂生产）。
1.1.3 标本 尿标本分别取自正常成人和肾脏疾病患者，按要求留取的24h尿液 ［2］ 。
1.2 方法和步骤
1.2.1 24h尿蛋白总量测定的具体步骤 尿蛋白主要有尿蛋白沉淀和双缩脲法测定蛋白浓度两个过程。
1.2.1.1 尿蛋白的沉淀 利用钨酸来沉淀尿蛋白 ［3］ ，取15ml的刻度离心管，加入24h尿液标本5ml，再依次加入25mlH 2 SO 4 （0.15mol/L）、2.5mlNa 2 WO 4 ·2H 2 O（1.5%）和1ml醋酸（50%），室温下静置10min。若蛋白定性为“++～+++”，则将尿样本用生理盐水按1∶5稀释;若为“+++～++++”，则将样本进行1∶10稀释;若为“++++”以上，则按1∶20或更高的稀释度进行稀释，重复沉淀步骤。离心（2000rpm×10min），弃去上清液，于沉淀中加入生理盐水至1ml，振荡重新溶解。
1.2.1.2 双缩脲法测定蛋白浓度 将4ml双缩脲试剂加入溶解的尿蛋白溶液，37℃水浴10min，同时分别以等渗盐水和蛋白标准液（50μl蛋白标准加生理盐水至1ml）做空白对照和标准对照。将经双缩脲显色反应后的标本离心（1500rpm×5min）。以空白管调零，波长540nm，1cm比色杯，分光光度计比色，测定各管的吸光度（OD）。若OD值>30，则取此显色后的混合液2.5ml，再加入0.5ml生理盐水和2.0ml的双缩脲试剂，重复显色步骤，测定其OD值（通过预先双缩脲法测定蛋白质的标准曲线的制作处理，得其OD值的线性范围的上限为30）。
1.2.1.3 参照蛋白标准对照，结合测定过程中的稀释倍数和24h尿液总量，计算出24h尿蛋白量。
1.2.2 取上述测定过程中蛋白定性程度高和一般的标本，直接进行沉淀、离心、显色和比色，计算其结果。与1.2.1.3的结果进行比较。
1.2.3 统计学处理 对检测结果的比较行t检验。
2 结果
尿蛋白定量检测步骤具体化后的结果表明尿液中蛋白定性在“++”以下的标本，蛋白定量结果测得值与真实值无偏离。但是，尿液中蛋白定性在“++”以上的标本，1.2.2和1.2.1.3的尿蛋白定量结果差异愈显著，并且尿液中蛋白定性程度愈高，检测结果之间的差异显著。
3 讨论
本文在常规检测尿蛋白浓度的基础上，首先根据蛋白定性的结果决定待检尿液是否需要进行稀释，使尿液中的蛋白质充分沉淀。蛋白定性在“++”以下的尿液标本，蛋白质可被充分沉淀，无需进行稀释处理。而对大量蛋白尿的尿液标本来讲，尿液中的蛋白不能被完全沉淀，如若不进行稀释处理，沉淀离心后取其上清液，重复沉淀，发现其蛋白定性仍可达“+”以上，蛋白定量结果就低于实际含量，与临床不相符合。尽管文献 ［3］ 中说明，蛋白定性在“+++”以上，才将标本进行1∶5稀释，但一般在常规检测中常忽略这一点。按照具体化的步骤，蛋白定性达“++”就应该稀释，并且定性程度愈高，稀释倍数愈大，有时标本可按1∶100进行稀释。
在沉淀过程中加入50%的醋酸目的有二:一是溶解尿液中的部分沉淀结晶;二是使混合液的pH值降低，更利于蛋白质的充分沉淀。
在双缩脲试剂显色过程中，Cu 2+ 被络合的饱和程度也是影响检测结果的因素之一，对于双缩脲试剂测定蛋白质这种经典的生化检测方法，标准曲线有其线性范围，在范围之内，蛋白定量结果可靠性程度高。双缩脲试剂中的Cu 2+ 络合蛋白质有完全络合和不完全络合两种情况。不完全络合的OD值在标准曲线的线性范围之内，蛋白含量结果可靠性程度高。Cu 2+ 完全络合说明蛋白量与Cu 2+ 量相当，或标本中蛋白量过高，即使Cu 2+ 被络合完全后，仍剩有游离的蛋白质，由此测得的OD值分布于线性范围上限附近或超出线性范围，使蛋白定量的检测结果低于实际的水平。因此，对OD值大于30的，应再进行处理。另外检测中发现，有些蛋白定性在“++”以下的尿液标本，若其OD值大于30，也需重新处理。
显色后离心是为了避免尿液中有形颗粒成分对OD值产生影响;另外，乳糜颗粒、某些药物的代谢产物也会对OD值产生影响。因而检测中还需注意这些因素的影响。评判OD值的可靠性，使结果更为准确。
正常尿液中的蛋白质含量极微，正常水平在150mg/24h以下。肾脏疾病和某些生理情况如剧烈运动等，尿蛋白含量可显著增加，做为重要的临床表现之一，尿液中蛋白量的变化不仅与肾小球的滤过屏障功能的变化有关，而且尿液中蛋白质参与对肾小管间质的损伤，且损伤程度与尿液蛋白浓度呈正相关 ［5］ 。检测步骤具体化后，大幅度地提高了测定结果的可靠性和准确度，为肾脏病的临床提供了重要而可靠的辅助诊治依据。按具体化的操作步骤，尿液中蛋白含量检测结果，与临床上严重低蛋白血症和水肿相符合。另外，在大量蛋白尿肾病患者的治疗过程中，24h尿蛋白定量的定期测定，对药物疗效的评判起到很好的检测作用。总之，双缩脲法检测24h尿蛋白定量，是简便易行的评价肾脏病的实验室方法。双缩脲显色蛋白之前，根据蛋白定性的结果进行尿液稀释是获得可靠检测结果的关键，但 其余注意点也不容忽视。
参考文献
1 D′Amico G.Clinical factors in progressive renal injury:the role of proˉteinuria.Am J Kidney Dis，1991，17:48-52.
2 Eric P Cohen，Jacob Lemann.The role of the laboratary in evaluation of kidney function.Clin Chem，1991，37（6）:785-796.
3 叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程，南京:东南大学出版社，1991，38.
4 马秀荣，孙加强.血清和血浆总蛋白双缩脲法测定结果的比较.临床检验杂志，1998，16:261.
5 Chen L，Wang Y，Tay YC，et al.Proteinuria and tubulointerstitial injury.Kidney Int，1997，61:606.
作者单位:454000河南省焦作市第二人民医院检验科