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Department of General Surgery，Shanghai Ninth Hospital，Shanghai Sec-ond Medical University，Shanghai200011，China.
【Abstract】 Objective This study was undertaken to investigate the clinical implication of reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）to detect lymph nodes micrometastases in Dukes A and B colorectal cancer pa-tients.Methods We examined492lymph nodes obtained from40colorectal cancer patients of Dukes A and B who underwent curative operation，using RT-PCR to detect the expression of cytokeratin20（CK20）mRNA.Eight lymph nodes proved pathologic positive were served as positive control and15lymph nodes obtained from2patients with be-nign disease as negative control.We also used serial dilution experiment to determine the sensitivity of this method.Results Among492lymph nodes，CK20mRNA expression was detected in53of17cases.CK20mRNA expression was detected in all positive control and undetected in all negative control.The results of serial dilution experiment in-dicated that the limit of sensitivity was1tumor cell per105normal lymphocytes.Conclusion CK20RT-PCR is a sensitive and specific method to detect lymph node micrometastases in colorectal cancer patients of Dukes A and B.
【Key words】 colorectal neoplasms;lymphatic metastases;micrometastase;genetic diagnosis;reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）;keratin20
大肠癌术后转移和复发是患者的主要死亡原因。行根治术的患者约有20%～40%在5年内出现转移或复发 ［1］ ，但这些患者在手术前后的常规检查中（包括手术探查、B超、CT等）并未发现显性转移，而微小的转移灶是客观存在的。我们将这些微小的存在于血循环、淋巴道、骨髓和其它各组织脏器中临床常规检查难以发现的转移灶称为微转移。微转移虽小，但有发展形成致命显性转移灶的可能，因此明确微转移的存在与否对确定最佳治疗方案和判断预后具有积极的意义。
淋巴结转移与否是判断大肠癌预后和指导术后化疗的重要指标，常规的病理组织学检查在敏感性等许多方面存在不足。因此，寻找一种敏感而特异的方法检测淋巴结中肿瘤转移尤其是微转移的存在具有重要的临床意义。本实验采用反转录-聚合酶链反应（Reverse-Transcriptase PCR，RT-PCR法）反转录并扩增Cytokeratin（CK）20基因的mR-NA，以检测大肠癌淋巴结微转移的存在。
1 材料与方法
1.1 材料 我院1999年1月～12月行根治性手术的Dukes A、B期大肠癌患者40例。男23例，女17例;年龄32～80岁（62.31±14.19岁）。结肠癌24例，直肠癌16例;Dukes A期6例，Dukes B期34例;肿瘤超过肠腔周径1/2的14例，未超过26例;膨胀型生长17例，浸润型生长23例;分化好8例，中21例，分化差11例。手术切除的标本立即分离淋巴结并取一小块肿瘤组织，每个淋巴结均一切为二，一半做常规病理切片HE染色，另一半液氮冻存直至RNA抽提，淋巴结总数492个，平均14.3个/例。此外，取2例良性胃肠道病变的15个淋巴结（1例胃溃疡患者10个，1例直肠腺瘤患者5个）作为阴性对照;取2例Dukes C期大肠癌患者的8个HE染色阳性淋巴结作为阳性对照。
1.2 RT-PCR法 本实验采用RT-PCR法定性检测CK20mRNA，同时选择管家基因磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参照证明抽提RNA的完整性。
1.2.1 RNA抽提 采用Trizol试剂（华舜产品）一步法抽提组织总RNA（具体步骤详见操作手册），取部分RNA样品稀释后测OD值，OD260/OD280在1.8～2.0之间，并换算浓度。
1.2.2 引物设计与合成 CK20基因全长18061bp，共有8个外显子和7个内含子，本实验所用的上游引物和下游引物分别位于第1和第3外显子，RT-PCR合成的片段包含第1外显子的后半段、第2外显子的全部和第3外显子的前半段。引物由Beckman Oligo1000M DNA合成仪合成，序列如下:
CK20 Sense Primer:5'-CAG ACA CAC GGT GAA CTA TGG-3'
Antisense Primer:5'-GAT CAG CTT CCA CTGTTA GAC G-3'GAPDH Sense Primer:5'-ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG-3'
Antisense Primer:5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-5
1.2.3 反转录合成cDNA和PCR反应 本实验采用Access RT-PCR试剂盒（Promega），反转录和PCR在同一试管、单一缓冲液中完成。每个RNA样品分别用CK20和GAPDH引物进行RT-PCR反应，步骤如下:在0.5ml离心管中依次加入无RNA酶的水，5×缓冲液5μl（终浓度为1×），dNTP0.5μl（终浓度0.2mM），CK20或GAPDH的上游和下游引物各0.5μl（终浓度1μM），25mMMgSO 4 1μl（终浓度1mM），AMV反转录酶、Tfl DNA合成酶各0.5μl（终浓度0.1U/μl）和1μg总RNA，整个反应体系25μl，加样过程在冰上进行。加样完成后，轻微振荡混匀，放入PTC-100TM热循环仪（MJ Re-search）。首先48℃45min进行反转录（cDNA第一链合成），然后94℃2min使AMV酶失活并使RNA/cDNA/引物变性，以后按以下条件合成cDNA第二链和进行PCR扩增。CK20引物存在时反应条件为94℃1min、62℃2min、68℃2min共40次循环;GAPDH引物存在时为94℃1min、63℃1min、68℃2min共30次循环，最后68℃7min。CK20和GAPDH扩增的终产物长度分别为370bp和626bp。同时用不加RNA的反应体系进行PCR扩增作为空白对照;不加AMV反转录酶进行PCR扩增排除基因组DNA的污染。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 取10μl RT-PCR产物在含0.5μl/ml溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳后的凝胶由Floruo-S Multi Image全自动图象分析仪（BIO RAD）扫描并打印成像。
1.2.5 测序 RT-PCR产物应用ABI PTISM BigDyeTMTer-minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq DNA Polymerase，FS（Perkin Elmer），经ABI PTISMTM377XL DNA测序仪检测序列。
1.3 敏感性检测 系列稀释试验。
1.3.1 肿瘤单细胞悬液的制备 肿瘤细胞来自一69岁女性盲肠癌患者，术后病理为高分化腺癌。手术标本取下后立即用生理盐水冲洗干净，剪除脂肪等非肿瘤组织，无菌情况下剪成1mm 3 的碎块;加入终浓度为0.1%胶原酶、0.01%透明质酸酶和0.02%DNA酶，4℃消化过夜;消化后的悬液用100目尼龙网过滤去除未被消化的组织碎块;按2:1的比例加入75%的淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），室温1800rpm离心20min，吸取中间云雾状的肿瘤细胞悬液;PBS漂洗2次;用含10%小牛血清的RPIM1640（Promega）培养液调整细胞数至5×10 5 /ml。
1.3.2 淋巴细胞分离 抽取一健康成人10ml外周静脉全血并肝素化，Hanks液2倍稀释后按2:1的比例加入淋巴细胞分离液，室温2000rpm离心20min，吸取中间云雾状的淋巴细胞悬液，PBS漂洗2次，计数约10 7 。
1.3.3 系列稀释和RT-PCR 将肿瘤细胞按10倍递减稀释成含细胞数10 5 ～10 0 的混悬液，分别混入10 6 个淋巴细胞中，抽提细胞总RNA，以后步骤和RT-PCR方法同1.2。
2 结果
2.1 肿瘤、对照样本 所有40例大肠癌患者的肿瘤组织和2例良性胃肠道疾病的病变组织（胃溃疡和直肠腺瘤组织）RT-PCR产物经电泳均可见370bp的条带（图1），即表示有CK20mRNA的表达;2例良性胃肠道病变的15个淋巴结RT-PCR结果均为阴性，而2例大肠癌患者的8个HE染色阳性淋巴结RT-PCR结果均为阳性（图2）。以上标本行GAPDH的RT-PCR产物均可见626bp的条带，证实RNA完整无降解。
不加RNA的反应体系作为空白对照进行PCR扩增结果为阴性;不加AMV反转录酶的反应体系进行PCR扩增结果为阴性，证实无基因组DNA的污染。
将存在CK20引物的RT-PCR产物进行测序，结果与Gene Bank检索所获得的序列一致，提示RT-PCR结果正确。
2.2 Dukes A、B期大肠癌患者的淋巴结样本 40例Dukes A、B期大肠癌的492个淋巴结，有17例（Dukes A期4例，Dukes B期13例）的53个淋巴结RT-PCR结果为阳性（图3），个数阳性率10.77%，例数阳性率42.50%。以上所有标本GAPDH的RT-PCR均阳性，证实RNA完整无降解。
2.3 敏感性试验 系列稀释试验显示:随着淋巴细胞中所含肿瘤细胞数量的递减，CK20的RT-PCR产物电泳条带的亮度逐渐减弱直至消失，10 6 个淋巴细胞中最少含10 1 个肿瘤细胞时，电泳可见极弱的条带，即本试验的敏感性为10 5 个淋巴细胞中可检测到1个肿瘤细胞存在（图4）。
3 讨论
在大肠癌的各种分期中，淋巴结转移与否具有重要的地位，它是判断大肠癌预后和指导术后化疗的重要指标。长期以来，临床上都采用单张病理切片HE染色判断淋巴结的转移情况。但仍有20%左右组织学证实淋巴结阴性的Dukes A、B期患者在术后5年内出现复发 ［1］ ，用连续切片法对阴性淋巴结进行重新检测，也发现近1/5的淋巴结存在转移 ［2］ 。因此，目前临床常规的病理组织学方法检出淋巴结转移的敏感性不够，不能发现微转移。
连续切片法可以提高淋巴结转移的检出率，但工作量过大，临床上难以推广。免疫组化从20世纪80年代中后期起开始用于淋巴结微转移的检测，CK、CC49等多种单抗被应用于检测 ［3～6］ ，尽管有助于检出微转移，但目前可供选择的抗体其特异性和敏感性还不能满足诊断的要求，能否作为推断预后的指标也存在争议 ［3～6］ 。作为一种形态学方法，它还存在阳性判断标准不一致的缺点，且切片的数量有限，不足以反映整个淋巴结的情况，费用也较高。因此，它也未能成为临床检测的常规手段。
近年来，随着分子生物学技术的发展，通过基因检测微转移已成为可能。目前基因检测主要是应用PCR技术，包括两方面的策略:一是检测肿瘤细胞基因突变或染色体重排所导致的DNA异常，报道的主要方法是突变等位基因特异性扩增（mutant allele-specific amplification，MASA） ［7］ ，可检测的基因有K-ras和p53等，但此法最大的障碍在于K-ras和p53突变在大肠癌只占一部分，首先要检测原发肿瘤的突变类型，未测得突变者便不能进一步对淋巴结进行检测，所以检测率低，步骤也较复杂，目前不能用以临床。另一种策略是RT-PCR，它通过反转录并扩增正常被检组织不表达而肿瘤或肿瘤来源组织表达的mRNA以证实微转移的存在，即只要被检组织存在肿瘤或其来源组织的mR-NA，就提示存在肿瘤细胞转移。
用于大肠癌淋巴结微转移检测的靶RNA主要包括CK和CEA等的mRNA，本实验选择的是CK20。CK属细胞骨架蛋白，广泛分布于上皮细胞和上皮来源肿瘤细胞的细胞浆，在间叶组织不表达。CK共有20种亚型，CK20是其中之一，它在正常人体内的表达主要局限于胃肠道上皮 ［8］ ，而在正常淋巴结的淋巴细胞和上皮细胞不表达 ［9，10］ 。同时，CK20在几乎所有大肠癌组织中均表达 ［11］ 。与其他较常用的靶RNA比较，CK19在正常淋巴结上皮亦有一定表达，同时存在假基因的问题 ［3］ ;CEA虽作为肿瘤标志物被广泛应用，但在大肠癌的表达水平存在变异。因此CK20较两者具有更高的特异性，是目前较为理想的选择。同时，本实验选择的引物跨越了3个外显子，避免了RNA样品因基因组DNA污染和错配所造成的假阳性，从另一个角度保证了方法的特异性。从本实验的结果来看，所有40例大肠癌患者的肿瘤组织和2例良性胃肠道疾病的病变组织均表达CK20mRNA，而2例良性胃肠道疾病的15个阴性淋巴结均不表达也证实了CK20的RT-PCR具有很高的特异性。
RT-PCR法具有很高的敏感性，只要存在极少量肿瘤组织的靶RNA，即可反转录并扩增获得阳性结果，通常可以在10 5 ～10 7 个正常细胞（如淋巴细胞、外周血细胞或骨髓细胞等）中检出1个肿瘤细胞 ［9，10，12，13］ 。系列稀释试验也证明本实验体系能在10 5 个正常淋巴细胞中发现1个肿瘤细胞。淋巴结样本的实验结果也表明，除HE染色阳性的8个淋巴结RT-PCR均为阳性外，原HE阴性的492个淋巴结中有17例的53个淋巴结RT-PCR为阳性，提示这些淋巴结中存在常规病理组织学检查所不能检出的微转移。这一点或许可能解释部分HE染色阴性的行根治术的大肠癌患者为何会出现复发。
通常，我们推断大肠癌患者的预后和选择术后的治疗方案主要是根据患者的分期，在国内普遍使用的是Dukes分期。Dukes分期的基本依据是肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移情况和远隔脏器的转移情况。但这些指标在指导治疗和判断预后等方面仍然存在着不足。比如说，Dukes A、B期的患者是指那些在术前、术中未发现有显性转移，术后的常规病理切片也未发现淋巴结转移的患者，我们能够对他们进行根治性手术，但这些患者依然有20%左右在术后5年内出现转移或复发，显然常规检查所谓的没有转移显然是站不住脚的，因此，根据常规检查所做出的分期也难以令人完全信服。而许多资料提示RT-PCR可以发现在这些患者的淋巴结、循环血液和骨髓等脏器中检出微转移 ［9，10，12，13］ ，既然原先的细胞病理的结果并不完全可靠，那么我们是否可以根据RT-PCR所得出的分子病理的结果取代原先细胞病理的结果对患者进行重新分期?将以上17例Dukes A、B期患者的分期改为Dukes C期?或者说这些患者是Dukes A、B期患者中的高危病例，应当进行更为积极的随访?是否也应该对发现微转移的患者采取更积极的治疗方案?是否也应该对检出微转移的Dukes A期患者进行化疗?较早应用RT-PCR技术开展研究的肿瘤如黑色素瘤，通过随访确实认为微转移的发生与肿瘤的复发和患者的预后有关 ［14］ 。但对于大肠癌，以上问题还需要大样本的研究和较长时间的随访才能得到答案。
当然，作为一种尚未被广泛应用的方法，RT-PCR法本身也有一定的不足和局限性。由于扩增目标为RNA，因此取材必须是新鲜组织，无法作回顾性研究，且技术要求较高，标本处理必须迅速，抽提和反转录时需预防RNA的降解，整个过程中要严格禁止标本间的交叉污染和基因组DNA的污染以避免假阳性结果的产生。但总的来看，它还是具有以下优点:（1）只要选择适当的靶RNA和引物，具有很高的敏感性和特异性;（2）RT-PCR能反映标本的整体情况而非局部断面;（3）操作方法固定易标准化，判断结果容易且准确，人为因素干扰少;（4）检测时间较短，能在24～48h时内得出结果，同时可检测多个标本。只要具备基本条件的分子生物学实验室均能进行。同时，CK20RT-PCR法除检测淋巴结外，也能对患者的血液、骨髓和腹膜腔的微转移灶进行检测，它将对临床处理提供更多的指导和参考，具有良好的应用前景。
（本文图片见附页1、2）。（略）
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作者单位:200011上海，上海第二医科大学附属第九人民医院普外科