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【摘要】 目的 观察丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）在神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）及去甲肾上腺素（NE）促心肌细胞肥大过程中的作用。 方法 进行原代乳鼠心肌细胞培养，使用髓磷脂碱性蛋白为底物，γ- 32 P-ATP为磷酸基来源，测定在NPY、NE作用过程中MAPK活性的变化。 结果 NPY、NE作用后5min内，MAPK活性即有明显升高，在15min达高峰，25min后仍显著高于对照组（P<0.01）;二者合用可使MAPK活性进一步增高（P<0.01）。 结论 作为一种快速、有力的信息传递工具，信息共同通路MAPK在NPY、NE生物学信息传导过程发挥了重要作用。
【关键词】 丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）;心肌细胞肥大;神经肽Y（NPY）;去甲肾上腺素（NE）
【Abstract】 Objective To investigate the role of MAPK on the hypertrophic effects of cardiomyocytes induced by NPY and NE.Methods Neonatal Wistar cardio-myocytes were cultured first，then the role of MAPK on the hyper-trophic effects of cardiomyocytes were investigated through measuring the activity of plasma MAPK in different condi-tions.Results 1.The plasma MAPK activity was significantly ascended when NPY or NE was added（P<0.01vs Control）;2.The plasma MAPK activity of NPY+NE group was significantly higher than NPY and NE group（P<0.01）.Conclusion 1.The growth-promoting effects of NPY and NE were acted through MAPK signal route;2.Be-ing factors which were co-secreted from sympathetic nerves，NPY and NE woked in coordination with each other in cardiomyocytes growth.
【Key words】 MAPK（mitogen-activated protein kinase）;cardiomyocyte hypertrophy;neuropeptide Y;NE
NPY是1982年发现的一种非肾上腺非胆碱类神经分泌的递质，具有显著的心血管活性 ［1］ ，可促进心肌细胞内蛋白合成。本实验采用培养的心肌细胞为模型，以NPY为直接刺激因素，直接观察MAPK在NPY促心肌细胞生长过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂 神经肽Y（美国Sigma公司），去甲肾上腺素（上海禾丰制药有限公司），γ- 32 P-ATP（北京亚辉生物工程公司）:放射化学纯度95%，放射性比浓度370MBq/ml，比活度>185TBq/mmol，铅瓶4℃储存。液体闪烁液:称取PPO4g，POPOP0.4g，溶于1000ml AR级甲苯中，再加入570ml无水乙醇，充分混合。髓磷脂碱性蛋白（美国Sigma公司）:-20℃保存。蛋白激酶抑制剂（美国Sigma公司）:-20℃保存。
1.2 乳鼠心肌细胞培养与鉴定 ［2］ 出生3天之内的Wistar乳鼠（由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供），培养乳鼠心肌细胞并用α-Actin免疫组化及电镜鉴定。
1.3 MAPK活性测定 方法基本按文献 ［3］ 。
1.3.1 MAPK酶液的制备 乳鼠心肌细胞用含10%新生牛血清的M199培养液培养，接种于95mm直径的培养皿，48h后换为无血清培养液，于接种后72h加不同干预因素。干预因素分组及终浓度:Control、NPY10 -9 M、NPY10 -8 M、NPY10 -7 M、NPY10 -6 M，NE10 -7 M，NE10 -7 M+NPY10 -7 M。刺激结束后用冰冷的0.15mmol/L PBS漂洗细胞3次，停止孵育，刮起贴壁生长的细胞，离心（2000g，30s），弃去上清，沉淀-70℃保存备用，用前解冻。将细胞沉淀置于5倍体积的溶解液［50mmo/L HEPES、pH7.5，150mmol/L NaCl、2mmol/L Na 3 VO 4 、100mmol/L NaF、10mmol/L NaH 2 PO 4 、2mmol/L DTT、2μg/ml aprotinin、20（mol/L Leupeptin、1mmol/L PMSF、1%（v/v）Triton X-100］中，冰上孵育30min，并超声破碎细胞5s，离心（13，000g，10min）去除沉淀，取上清，按Bradford法蛋白定量后直接留作MAPK活性测定。
1.3.2 MAPK活性测定方法 取上述酶液（蛋白量至少40μg），加入激酶缓冲液［20mmol/L HEPES，pH7.2，10mmol/L MgCl 2 ，2mmol/L MnCl 2 ，2mmol/L DTT，0.5mmol/L Na 3 VO 4 ，0.1mg/ml BSA，2mmol/L蛋白激酶抑制剂，1mg/ml MBP，2.0μCiγ- 32 P-ATP（1×10 6 cpm）］，在25℃孵育25min，将反应液收集于49型玻璃纤维滤纸上，0.5%磷酸彻底冲洗，烤干，加入5ml液闪杯中，静置过夜，在LS-6500型液闪计数仪上测定MBP中的 32 P掺入量。空白对照组不加酶液样本，其余操作相同。实验管与空白管 32 P放射活性的差值表示MAPK的活性（以每分钟每毫克蛋白质掺入 32 P的放射活性计数cpm值表示）。
1.4 统计学处理 所有数据以均值±标准差（ˉx±s）表示，应用Eztate2统计软件进行方差分析、t检验。结果以P<0.05为差异有非常显著性，P<0.01为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 NPY对心肌细胞胞浆内MAPK活性的影响
2.1.1 NPY作用浓度与心肌细胞胞浆内MAPK活性的关系 10 -9 MNPY即可使心肌细胞胞浆内MAPK活性明显增加，与Control组相比差异有非常显著性（P<0.01），随着NPY浓度的提高，心肌细胞胞浆内MAPK活性呈剂量依赖性地增加，到10 -6 M时作用基本稳定（见图1）。2.1.2 NPY作用时间与心肌细胞MAPK活性的关系 NPY10 -7 M作用5min，即可使胞浆MAPK活性明显升高（见图2），与对照组相比差异有非常显著性（P<0.01），此作用呈时间依赖性;NPY10 -7 M作用15min组变化最为显著;NPY作用25min后，胞浆MAPK活性仍较对照组为高，与对照组相比差异有显著性（P<0.05）。
2.2 NPY与NE合用对心肌细胞MAPK活性的影响 见图3。NPY10 -7 M与NE10 -7 M合用时，心肌细胞胞浆内MAPK活性进一步增加，与NPY10 -7 M组、NE10 -7 M组相比差异均有显著性（P<0.05）。
3 讨论
NPY是1982年从猪脑中提取出来的一种含36个氨基酸的多肽，为非肾上腺非胆碱类神经分泌的递质，心脏、血管组织中均有能分泌NPY的此类神经纤维及特异的受体存在 ［4］ ，主要由交感神经末梢和NE一同分泌。NPY对血管平滑肌细胞的作用目前较明确的有:（1）可直接收缩血管;（2）增强血管对缩血管物质的反应性;（3）减轻血管对缩血管物质的脱敏性;（4）减弱血管对舒血管物质的反应性;（5）促进血管平滑肌细胞的增殖等 ［5］ ;且其在高血压病患者、心力衰竭患者、自发性高血压大鼠血浆中含量明显升高，在高血压病、心力衰竭的发病过程中发挥了重要作用 ［6］ 。实验证明NPY促进了心肌细胞的蛋白合成速度，具有明显的促心肌细胞肥大作用。初步推测其生物学作用的发挥机制为NPY作用于心肌细胞膜上的特异性受体，触发胞内的生理生化改变，并将此信号逐步传递到胞内的反应部位，引起细胞的生长肥大效应。
NE是调节心血管功能调节的重要体液因素，已被多次证实可促进心肌细胞生长肥大 ［7］ ，且与NPY至少在促心肌细胞肥大效应上具有明显协同效用。
丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）是一组胞浆内广泛分布的含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白质激酶，又称细胞外信息调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERKs），目前认为，MAPK是细胞增长信号刺激脊椎类动物细胞增殖、分化的细胞内信息传递的交汇点或共同通路，综合着受体-蛋白和受体-蛋白酪氨酸传来的信息，有“信息汇聚点之称” ［8］ 。MAPK在体外可使髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）的苏氨酸残基磷酸化，Ser/thr-pro为其特异性作用序列。MAPK激活后至少可产生两种效果:一是直接磷酸化一些转录因子如AP-1、C-myc、C-jun等，二是激活如P90 RSK 和MAPK活化蛋白激酶2（MAPK-activated protein kinase2）等，然后由此来启动一系列胞核和胞浆反应的发生。在基因 水平改变的有初级应答基因和次级应答基因反应，初级应答基因主要为核内癌基因如fos、myc、myb、jun、erbA、egrL等，表达出现快，消失也快，其基因产物多为转录调节因子，它们作用于次级应答基因的一些5′-端调控序列，调节一些与细胞增殖、肥大有关的蛋白基因的变化。次级应答基因继发于初级应答基因的改变，其表达在转录水平受初级应答基因表达产物的调控，对刺激的应答启动晚，持续时间长，可直接引起肌蛋白合成、细胞体积增大、激素分泌、间质细胞增殖与胶原合成等，从而影响细胞的生长与增殖 ［9］ 。
本实验使用髓磷脂碱性蛋白为底物，γ- 32 P-ATP为磷酸基来源，测定了在NPY、NE作用过程中MAPK活性的变化，发现在NPY、NE作用后5min内，MAPK活性即有明显升高，在15min达高峰，25min后仍显著高于对照组;二者有显著协同作用。说明MAPK作为一种快速、有力的信息传递工具，参与了NPY、NE促心肌细胞生长的过程。
（本文图片略）
【参考文献】
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作者单位:1 100089北京，解放军第四六六医院内二科
2 610015重庆，第三军医大学大坪医院心内科
（编辑:罗 彬）