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Home医源资料库在线期刊中华医学实践杂志2005年第4卷第11期

实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒的比较研究

来源:中华医学实践杂志
摘要:【摘要】目的通过2种检测登革病毒方法的比较,以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法利用TaqmanMGB技术,根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳......

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    【摘要】  目的  通过2种检测登革病毒方法的比较,以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法  利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果  RT-PCR检测10份临床血清标本,2份阳性,阳性率为20%。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应,检测10份临床血清标本,5份阳性,阳性率为50%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论  Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。

  【关键词】  登革病毒;RT-PCR;Taqman GMB实时PCR
   
  Comparative study of detecting dengue viruses with real-time fluorescent PCR and RT-PCR

  LIU Jian-jun, GU Li-bahaer, YANG Fan, et al.

  Shenzhen Center for Diseases Control and Prevention,Shenzhen  518020,China

  【Abstract】  Objective  In order to improve the sensitivity and specificity of detecting dengue viruses, two methods for detecting dengue viruses were compared.Methods  Using Taqman MGB technique, a pair of universal primers and Taqman MGB probe were designed according to a highly reserved sequence of the 3’-noncoding region of dengue viruses type 1-4. Dengue virus strains were used as standard and Japanese encephalitis virus strains were used as control, the real-time PCR assay for specific and sensitive detection of the dengue viruses was established. While 10 serum specimens of ELISA positive were detected by the RT-PCR and fluorescent PCR.Results  There was no cross-reaction with Japanese encephalitis virus. Of 10 specimens, 2 was positive by RT-PCR and 5 was positive by real-time PCR. The test could be completed in 4 hours.Conclusion  The Taqman MGB real-time PCR assay was fast, sensitive and specific. It could be applied to the quick early diagnosis of dengue viruses.

  【Key words】  dengue virus;RT-PCR;Taqman GMB real-time PCR

    登革热是流行于热带、亚热带地区的一种急性虫媒传染病,其病原体为登革病毒,近年来随着全球气候变暖和国际旅游的增多,登革病毒感染呈扩大蔓延之势,发病率不断升高。由于缺乏疫苗和有效的防治措施,因此对该疾病实行早期诊断十分必要。

  登革病毒属于黄病毒科黄病毒属, 为单股正链RNA病毒,基因组长约11kb。依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型(DEN1~4)[1,2]。登革病毒感染的实验室诊断,传统方法是从患者血清中分离病毒,或用血清学方法检测病毒的特异性抗体。但病毒分离费时,检测血清抗体需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清, 同时存在广泛的交叉反应而受到干扰[3],这些均不利于疾病的早期诊断。近年来国内外均有报道应用RT-PCR检测登革热病毒[4],但RT-PCR方法容易造成污染,同时也存在从临床血清标本中检测登革病毒敏感性不够的问题。这就需要建立一种更敏感、特异和快速的检测鉴定方法,以实现对登革热患者的早期快速诊断,为预防控制登革热的流行赢得时间。本研究比较了利用TaqmanMGB探针技术的实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒特异性,以期选择特异性好、灵敏度高的检测方法,达到快速诊断登革热的目的。

  1  材料与方法

  1.1  毒株及血清标本  登革病毒1~4型标准株由广东省疾病预防控制中心提供,乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株由成都生物制品所提供。血清标本采自深圳市近几年发病2周内的疑似登革热病人和发病10天内的疑似乙脑病人,-80℃保存。

  1.2  主要试剂  病毒RNA提取试剂盒为Roche公司产品,TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、随机引物购自Invitrogen公司,dNTP购自上海生工公司, AMV逆转录酶、RNaseinhibitor购自大连宝生物公司,引物和荧光探针由上海基康生物技术有限公司合成及标记,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

  1.3  主要仪器设备  Centrifuge 5415D台式高速离心机购自德国Eppendorf公司, Ultrospec 2000紫外可见光蛋白核酸分析仪购自美国GE公司, 9700基因扩增仪购自美国ABI公司,Gene Genius凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司, Mx4000荧光PCR仪购自美国Stratagene公司。

  1.4  引物及探针设计  在GeneBank上检索登革病毒4个血清型中都一致的高度保守序列,根据登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列,设计登革1~4型RT-PCR通用引物,扩增片段长度为511bp。根据DEN 3端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和Taqman探针,探针5’用FAM报告荧光基团标记,3’用MGB淬灭荧光基团标记,扩增片段长度为68bp。

  登革病毒RT-PCR通用引物:

  Den-D1: 5’ TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG 3’
Den-D2: 5’ TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC 3’

  登革病毒荧光PCR通用引物:

  Den-FP: 5’ GCATATTGACGCTGGGAGAGA 3’
Den-RP: 5’GGCGTTCTGTGCCTGGAAT 3’

  登革病毒通用探针:

  Den-Probe:5’ FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB 3’

  引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记。

  1.5  病毒RNA提取  1~4型登革病毒标准株用1640培养液溶解,接种C6/36细胞,传代次,按病毒RNA提取试剂盒说明书操作,提取病毒RNA,RNA置-80℃保存备用。

  1.6  反转录及普通PCR

  1.6.1  RNA逆转录  反应总体积为20μl,在反应管内依次加入:5×缓冲液5μl,2.5mmol/L 4×dNTP 1μl,0.3μg/μl Random(Invitrogen公司生产)引物1μl,提取的RNA 12μl,AMV逆转录酶(10u/μl)1μl混匀。反应条件为:42℃ 60min→95℃加热5min→4℃保存。然后将产物放置于-20℃备用。

  1.6.2  PCR扩增  反应总体积为20μl,在反应管内依次加入:10×缓冲液2μl,2.5mmol/L,4×dNTP 1μl,25mmol/LMgCl2 2.5μl,通用引物D1、D2(5μmol/L)各1μl,RT产物0.5μl(Ⅰ型,Ⅱ型,Ⅳ型)、2μl(Ⅲ型,血清标本,阴性对照),Taq酶(5u/μl) 0.25μl,加H2O补足体系。反应条件为:94℃ 5min→94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,循环40次→72℃延伸10min→4℃保存。

  1.6.3  扩增产物电泳分析  配制含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶,取10μlPCR产物电泳,在凝胶成像仪上观察并照相记录实验结果。

  1.7  实时荧光PCR  反应总体积为25μl,在反应管内依次加入:10×缓冲液2μl,10mmol/L 4×dNTP 0.75μl,50mmol MgCl2/L 2.5μl,引物Den-FP,Den-RP(10μmol/L)各0.5μl,探针Den-probe(5μmol/L)0.6μl,RT产物0.5μl(Ⅰ型,Ⅱ型,Ⅳ型)、2μl(Ⅲ型,血清标本,阴性对照),Taq酶(5u/μl)0.25μl,加H2O补足25μl体系。反应条件是:50℃ 2min→95℃ 10min→95℃ 30s→60℃ 30s,循环40次→4℃保存。采用MX4000实时荧光PCR扩增仪进行扩增,延伸阶段检测荧光。

  2  结果

  2.1  普通RT-PCR检测结果  1~4型登革病毒标准株、10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清,其IgM、 IgG检测为阳性,乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株进行RT-PCR检测,在511bp处1~4型登革病毒标准株都出现了目的基因条带,10份疑似登革病毒感染病人血清只有2份出现目的基因条带,其他标本都为阴性,见图1(略)。说明此RT-PCR检测体系具有良好的特异性。注: DNA分子质量标准;1~4分别为Ⅰ~Ⅳ型登革毒株;
5~13血清标本(其中5和8为同一标本);14、15为乙脑病毒对照;-为空白对照

  2.2  登革病毒Taqman MGB PCR体系检测结果

  2.2.1  有效性检验  按1.7方法,分别提取登革病毒1~4标准株RNA,进行反转录的实时PCR,1~4型均观察到荧光信号增强。

  2.2.2  特异性分析  登革病毒1~4标准株、乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株经TaqmanMGB体系检测,只有登革病毒1~4标准株观察到荧光信号增加外,乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株均没有荧光增加信号,见图2(略)。这证明了此TaqmanMGB检测体系的特异性。

  2.2.3  登革病毒TaqmanMGB PCR检测体系的应用  用Ⅱ型登革病毒作为阳性对照,对10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清,其IgM、 IgG检测为阳性,8份发病10天内疑似乙脑病毒感染病人血清作为对照,其IgM、 IgG检测为阳性。进行TaqmanMGB PCR检测,结果只有5份疑似登革病毒感染病人血清出现荧光信号增加,其他血清标本均无荧光信号。见图(略)3。注:1、2、3、4分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ登革病毒标准株  注:1:Ⅱ型登革病毒标准株;2~6:疑似登革病毒感染病人血清标本

  3  讨论

  Taqman探针是一条与病原体核酸特异性结合的荧光素标记探针,它的结合位点位于普通PCR的2条引物之间[5]。探针的5’端和3’端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团,PCR扩增在加入一对引物的同时加入荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时, Taq酶发挥它的5’→3’的外切酶功能,将探针切成单核苷酸,5’端发出的荧光信号不再被3’端所吸收而能被仪器检测到。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此,随着PCR产物的不断增加,仪器所检测到的荧光信号越来越强。当标本中不含病原体时,PCR反应不发生,不产生荧光信号,其扩增曲线为一水平线。

  TaqmanMGB探针是在Taqman原理基础上提出的[6]。TaqmanMGB探针的突出优点是实验优化、步骤简单,提高了配对与非配对模板间的Tm值差异,由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团,并且与报告基团在空间位置更接近,使杂交的稳定性和重复性大大提高,实验的结果更精确,分辨率更高。

  笔者在TaqmanMGB技术基础上,建立了实时PCR检测1~4型登革病毒的方法。上述研究结果表明:(1)本检测方法可靠性好、敏感性高,比普通PCR方法灵敏度提高30%,可检测发病10天内的临床血清标本,而传统的登革病毒分离方法要求发病5天内的标本,才有可能分离出阳性。(2)特异性强,收集荧光在较高的退火温度(60℃)进行,排除了模板的非特异性扩增,同时,与容易造成血清学交叉反应的乙脑病毒及其临床标本都无交叉反应,可用于登革病毒特异性的实时PCR检测。(3)操作简单,结果观察直观明了,采用闭管检测和荧光技术,避免了普通PCR方法容易产生交叉污染而发生非特异性扩增的缺陷,并可防止病毒扩散及环境污染,以及强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。(4)快速。传统的登革病毒分离方法耗时较长,至少需半个月,而本方法所需时间仅4h,比传统方法大为缩短,适用于登革病毒的快速准确的检测。

  【参考文献】

  1  肖维威,马文丽,郑文岭.登革病毒的基因组结构及其基因检测.中华检验医学杂志,2003,26(3):188-189.

  2  Jelinek T. Dengue fever in international travelers. Clin Infec Dis,2000,31:144-147.

  3  Schwartz E, Mileguir F, Grossman Z,et al. Evaluation of ELISA-based sero-diagnosis of dengue fever in travelers. J Clin Virol,2000,19(3):169-173.

  4  Drosten C, Gottig S, Schilling S, et al. Rapid detection and quantification of RNA of ebola and marburg viruses, lassa virus, crimean-congo hemorrhagic fever virus, rift valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol,2002,40(7): 2323-2330.

  5  Callahan JD, Wu SJ, Dion-Schultz A, et al. Development and evaluation of serotype-and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. J Clin Microbiol,2001,39(11): 4119-4124.

  6  Zhao JR, Bai YJ, Zhang QH, et al. Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology. World J Gastroenterol,2005, 11(4):508-510.

  作者单位:1 518020 广东深圳,深圳市疾病预防控制中心

       2 839000 新疆哈密,哈密地区疾控中心

  (编辑:齐  永)


 

作者: 刘建军,古丽巴哈尔,阳帆,陈家敏,何雅青,杨洪 2006-8-20
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