四川省O1群霍乱弧菌分子流行病学特征

    【摘要】  目的  从分子水平分析四川省不同地区、不同年代O1群霍乱弧菌的致病性以及菌株分子特征和相互关系；为了解四川省霍乱流行规律、预测疫情、制定防治措施提供理论依据。方法  运用打点杂交或PCR方法检测霍乱弧菌毒力基因ctxA，16S rRNA探针Southern杂交进行核糖体基因分型分析等。结果  所试菌株2株ctxA基因阴性，其余阳性；16S rRNA核糖体分型可分为6个RT型。结论  除82-007、95-001外，所试菌株均具有致病性；20世纪90年代以前四川省发生的霍乱为输入性，90年代后四川省流行的菌株高度同源，具有地方疫源性；2001、2002年在四川省乃至全国引起大流行的稻叶1d为同一RT型，为传入性霍乱；噬菌体分型6型、13型菌株和1型菌株可能来自同一克隆系。

    【关键词】  霍乱弧菌；O1群；分子流行病学；特征
   
　　The molecular epidemiology character of Vibrio cholerae O1 in Sichuan province

　　Liu Hong-lu，Luo Long-ze，Feng Ze-hui, et al.

　　Center for Disease Control and Prevention of Sichuan Province, Chengdu 610031, China

　　【Abstract】  Objective  To analyse pathogenicity of Vibrio cholerae O1 from different areas and different years, to understand the molecular characters and relations between strains, on the purpose of providing a basis for epidemic prediction and policy making for cholera control.Methods  Testing toxic gene ctxA by Dot hybridization, ribotyping by 16S rRNA probe Southern hybridization. Results  All strains were ctxA positive except two. 16S rRNA typed 6 patterns. Conclusion  All strains were pathogenetic except 82-007 and 95-001. Different from the importation characteristic before 90s, strains after 90s were highly isogenous, suggested that the cholera epidemics in Sichuan province after 90s were endemic source. Inaba 1d strains from national wide epidemic in 2001 and 2002 were the same RT. Strains typed as different phagetypes (phagetype 6, phagetype 13 and phagetype 1) might be from a same clone.

　　【Key words】  Vibrio cholerae;O1 strain;molecular epidemiology;characteristics

    1982年霍乱首次传入四川省以来，除1987、1988、1990、1991年无病例报告外，每年均有病例发生。1998年四川发生了大规模的霍乱流行并且霍乱弧菌菌型发生了较大改变，以前被列为非流行株的噬菌体分型6型［1］以及13型霍乱弧菌，在四川省凉山州引起了爆发和流行，而且有向外扩散的趋势。为了从基因水平上分析霍乱弧菌的致病力，了解四川省各地、各年代病原体之间的遗传相关性，分析霍乱流行规律，为制定防治措施提供依据；笔者运用打点杂交、16S rRNA核糖体基因分型等分子生物学方法对四川省历年有代表性的O1群霍乱弧菌进行了研究，现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验用菌株 

　　所试菌株（包括外环境）均分离自四川省各次霍乱疫情处理，所有菌株经霍乱弧菌两个生物型鉴定，均为O1群El tor生物型，菌株编号前两位代表分离年份。

　　1.2  试剂 

　　Dig-ctxA、Dig-16S rRNA基因探针由中国CDC传染病预防控制所腹泻病室制备，限制性内切酶BglI、TaqDNA聚合酶为华美公司产品，dNTP、Dig标记和检测试剂盒为Roche公司产品，0.45μm硝酸纤维素滤膜为浙江省台州市路桥四青生化材料厂生产。

　　1.3  实验方法 

　　染色体DNA提取、打点杂交、PCR、Southern杂交均参照文献［2］，染色体DNA提取在文献基础上略有改动［3］，PCR检测ctxA基因引物序列参照文献［4］。

　　2  结果

　　ctxA基因打点杂交结果见表1，仅82-007、95-001两株菌ctxA阴性，其余受试菌株均为阳性；16S rRNA核糖体分型共分为6个RT型，参见表1、图1。表1  四川省O1群霍乱弧菌菌株来源及检验结果（略）

　　3  讨论

　　随着新技术新方法的建立和完善并运用于病原微生物的研究，使我们能够从基因水平研究病原体的致病力及相互关系；霍乱弧菌毒力及毒力相关基因发现和了解，使我们可以从分子水平检测其致病性；核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具，它在核酸的结构和功能的研究中起着重要作用，尤其通过核酸分子杂交，对病原菌进行分子分型，找寻菌株间的内在关系，对于追踪传染来源具有独特的优势。

　　3.1  ctxA基因打点杂交分析

　　霍乱肠毒素（CT）是霍乱弧菌主要致病因素［4］，CT的编码基因位于霍乱弧菌染色体DNA上，CT基因的有无是判断霍乱弧菌毒力强弱的重要指标；CT是典型的A－B亚单位型毒素，A亚单位包含毒素的生物活性部分，B亚单位为非毒素蛋白，笔者选用编码毒素A亚单位的基因（ctxA）作为探针来检测霍乱弧菌的CT基因。CT基因检测结果仅82-007、95-001两株菌阴性，说明这两株菌目前可能不致病，其余菌株均具有致病性。82-007、95-001两株菌均为疫情处理时从病人或病人污染物分离所得，所以其最初应该是致病的，其现在CT基因阴性可能是实验室反复传代造成的变异，或其他毒力因子造成的腹泻。因为近年来对霍乱弧菌的研究发现毒素基因ctxAB由溶源性噬菌体CTX携带［5，6］，该噬菌体以TCP菌毛为受体，通过attRS位点整合到染色体上，在霍乱弧菌间水平转移；82-007经检测具有TCP菌毛，所以82-007虽然ctxA阴性，但其具有tcpA基因，它有可能获得CTX而变为产毒株。噬菌体分型6型在以前的霍乱防治手册中被列为非流行株；通过本次检测，噬菌体6型菌株均具有CT基因，该型菌株从1998年～2001年连续4年在四川省凉山地区暴发流行，已形成地方性，新版霍乱防治手册将其重新划归为流行株范畴［4］，说明运用CT基因检测来区分霍乱弧菌的致病性比噬菌体分型可能更确切。

　　3.2  核糖体分型分析

　　3.2.1  rRNA的编码基因是细菌进化过程中最为保守的基因

　　以限制性内切酶酶切再与16S rRNA基因探针杂交进行核糖体分型目前已广泛应用于霍乱弧菌的分子流行病学研究。在本次实验中，笔者运用此方法，将四川省不同地区、不同年代的112株El tor霍乱弧菌分为6个RT型。

　　3.2.2  RT1型菌株 

　　为四川省的优势核糖体型，受试菌株中该型别从1994～2001年间共67株菌，占59.82%，RT1型菌株8年时间波及了四川40个地区（相同地区不同年代重复计次），与新疆、山东、广东、广西以及浙江省等同期优势菌型－致［7～9］。RT1型包括小川1b、6b、13b和稻叶1b、6b型菌株，说明同一核糖体型可以是不同的血清型和噬菌体-生物型。噬菌体分型6型、13型菌株和1型菌株可能来自同一克隆系。噬菌体6型和13型菌株可能是1型菌株在四川省凉山地区恶劣气候和环境压力下（高寒、高海拔、强紫外线）、噬菌体受体等发生变异，但其致病力和存活力却未变化，导致其噬菌体分型发生改变［10］。该结果提示：在霍乱防治工作中对噬菌体分型结果为非流行株范畴的O1群霍乱弧菌也应引起关注，尽快做毒力基因检测，以确定菌株的致病力。

　　3.2.3  RT6型菌株 

　　29株RT6型菌株为稻叶1d和两株粗糙血清型霍乱弧菌，该型菌株持续2001～2002年，波及10个地区；两株粗糙血清型刚鉴定时为稻叶1f，与四川省绵阳地区分离的另5株稻叶1d霍乱弧菌为同一起聚餐性食源型爆发分离所得［11］，它们除了血清型发生改变外，其余特征完全相同，说明两株粗糙血清型菌株为O1群霍乱弧菌变异株，并且变异是经过了噬菌体-生物分型变异这个中间环节，再变异为粗糙型霍乱弧菌。RT6型菌株与同年广东、广西、浙江、江西的稻叶1d相同；全国首例稻叶1d霍乱弧菌4月初在广东省东莞市发现，4月底后四川省陆续出现稻叶1d霍乱弧菌引起的霍乱流行，四川省民工到广东打工人员众多，从而推测四川省2001年的稻叶1d霍乱弧菌很可能来自广东［9］。RT6型稻叶1d霍乱弧菌2001年在全国突然出现并引起爆发流行，该核糖体型东南亚出现过，2001年在我国从未见过报道，推测由国外传入。从以往对传染性疾病的认识来看，新菌型的出现，意味着大爆发可能到来，新出现菌型稻叶1d在2002年并未大幅上升，是因为该型细菌生存能力不强还是无合适的生存环境还值得继续研究。

　　3.2.4  RT3型菌株 

　　96-011与96-013、96-017流行病学调查显示为同一传染源［12］。而核糖体分型却有差异，估计96-011的rRNA基因在实验前发生了变异。同时也说明，相同血清型和噬菌体-生物分型菌株可以为不同RT型。

　　3.2.5  RT2型和RT5型菌株 

　　为四川省80年代分离的菌株，该型与90年代有明显差异，结合流行病学资料，确定其为传入性霍乱，且未在四川省扎根。

　　3.2.6  RT4菌株 

　　1997年布托地区的菌株，噬菌体分型为1型，核糖体型却为比RT1少一条带的RT4，来年就在该地发生了噬菌体分型6型菌株引起的霍乱爆发流行，此核糖体基因型是否与噬菌体分型6型菌株的来源有某种联系还有待研究。

　　综上所述，所试菌株除82-007、95-001外均具有致病性。分子生物学以及流行病学研究结果支持噬菌体分型6型菌株应属于流行株范畴。90年代后四川省流行的霍乱弧菌具有高度同源性，噬菌体分型6型菌株与1型菌株可能来自于同一克隆系。82-007一直作为四川省霍乱菌株鉴定的标准株，为1982年从病人污染物（拖把）上分离所得，95-001在进行分子生物学实验前一直鉴定为小川1b，现变异为粗糙型，这两株菌是实验室反复传代过程中CT基因丢失还是分离时其CT基因就阴性现在已无法区分；96-011的RT型不一样，现在也只能估计而不能肯定是在实验室保存过程中发生了变异，说明分离到霍乱菌株后应尽快做分子流行病学分析，否则不便于一些结果的解释。

　　（致谢：本次实验得到中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室刘延清研究员、阚飙博士、徐菁、芮勇宇博士后等老师的指导帮助，广东、广西、浙江等CDC同仁的支持，在此表示感谢。）

　　【参考文献】

　　1   卫生部防疫司.霍乱防治手册，1987，93.

　　2   J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第2版.北京：科学出版社，1999，35.

　　3   刘红露，尹致英，冯泽惠，等.四川省1982～1998年O1群霍乱弧菌的分子流行病学特征．中国预防医学杂志，2001，2(增刊)：272-276.

　　4  卫生部防疫司.霍乱防治手册，1999，82.

　　5   阚飙，刘延清，祁国明，等.中华流行病学杂志，1998，19（3-B）：218-222.

　　6   S.Kar,R.K.Ghosh,A.N.Ghosh,et al.Integration of the DNA of a novel filamentous bacteriphage VSK from Vibrio cholerae O139 into the host chromosomal DNA.FEMS Microbiol Lett，1996，145:17-12.

　　7   刘捷.高涛.蒋梦渔，等.新疆O139霍乱弧菌的分子生物学特性的研究.中华流行病学杂志，1996，17(5-B)：374.

　　8   杨彬,毕振强,于，等.山东省1993～1997年霍乱弧菌分子流行病学特征.中华流行病学杂志，1999，20(专刊1)：353-357.

　　9   钟豪杰，黎薇，谭海玲，等.广东省2001年O1群霍乱弧菌RT分型分析.中国预防医学杂志，2003，4（增刊）：144-147.

　　10  刘红露，冯泽惠，尹致英，等.四川省O1群霍乱弧菌突变株的鉴定分析.预防医学情报杂志，2004，20(3)：321-323.

　　11  冯泽惠，刘红露，祝小平，等.一起“农家乐”就餐引起霍乱暴发的霍乱病原学分析.中国预防医学杂志，2003，4（增刊）：161-162.

　　12  四川省新都县卫生防疫站.一起食物型霍乱暴发流行的调查和处理.中华流行病学杂志，1997，18(5-B)：252-255.

　　作者单位 ： 610031 四川成都，四川省疾病预防控制中心

　　(编辑：黄杰)

　　(收稿日期：2005-11-02)