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【摘要】 在成功克隆A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因［1］并实现在大肠杆菌中的高效表达［2,3］后，为获得A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原(cpa408蛋白)鸡卵黄抗体，以纯化的表达蛋白为抗原，免疫SPF级鸡后，提取制备卵黄抗体IgY,为α毒素的检测提供材料。
【关键词】 保护性抗原；卵黄抗体；制备
Production of egg yolk antibody(IgY) of alpha-toxin's protective antigen of clostridium perfringens type A
LIN Ming-hui，WANG Hui-xuan.
Laboratory Department of General Hospital of Kunming,Yunnan 650032，China
【Abstract】 After having been successfully cloned, the alpha-toxin's protective antigen's gene of Clostridium perfringens type A was highly expressed in E.coli DH5α. Celleted by 80%(NH4)2SO4 and dialysised, the expressed protein was isolated and purified. Then according to an amount of 1.0mg/Kg, the hens(SPF degree and aged 30 weeks) were immuned with the purified protein individualy by multiple muscle injection . During the period of immunization, the titre of the egg yolk immunoglobulin(IgY) was measured by ELISA. From one week to eleven weeks after the first immunization, the titre of IgY rose from 1:800 to 1:25600. By ELISA and double immunological diffusion， the IgY could react well with the expressed protein and alpha-toxin, which assumed that the IgY could be applied to the examination of the alpha-toxin.
【Key words】 protective antigen；egg yolk antibody；production
鸡属于非哺乳类动物，与人类亲缘关系较远，对人类的病原体及哺乳动物高度保守的蛋白质能产生强免疫应答。从免疫鸡卵黄易获得大量特异性多克隆抗体（IgY）。与哺乳动物IgG相比，鸡卵黄抗体IgY具有许多突出的优点：作为免疫检测试剂，它不会活化标本中的补体系统［4］，不与蛋白A结合［5］，也不与类风湿因子结合［6］，从而避免哺乳类IgG假阴性和假阳性结合的干扰；而且IgY来源方便、经济，可大规模生产［7］。国内已有病毒［8］,细菌［9］等颗粒性抗原诱导鸡卵黄表达特异性抗体的报告。为获得鸡卵黄抗体，以重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原免疫SPF级鸡，制备提取IgY，为α毒素的检测提供材料。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1．1 实验动物
30周龄SPF级产蛋鸡。
1．1．2 主要试剂和仪器
重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原，本室储存；福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂，为SIGMA公司产品；0.1MHCl，饱和硫酸铵，pH7.4PBS缓冲液及相关酶联检测试剂，自己配制；HRP标记 抗鸡二抗，购自上海生物制品研究所。MicroReader 4 Plus 自动酶标仪，为Hyperion公司产品。
1．2 方法
1．2．1 动物免疫实验
按1∶1的比例混匀重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原与福氏完全佐剂并乳化完全后，以1.0mg/kg剂量多点肌肉注射进行初次免疫；分别间隔2周，按1∶1的体积比混匀抗原与福氏不完全佐剂并乳化完全后，1/2剂量进行第2、3次免疫；然后再分别于第8、11、13周，按1∶1的体积比混匀cpa408蛋白与福氏不完全佐剂并乳化完全后，以1.0mg/kg剂量加强免疫。
1．2．2 鸡卵黄抗体的提取
用0.1MHCl调节一定量体积双蒸水pH值至4.0～4.4，按80～100ml pH4.0～4.4双蒸水溶解一鸡卵黄，混匀鸡卵黄液，4℃过夜； 12000r/min,4℃离心30min，取上清，加入硫酸铵至饱和度33%，4℃静置4～5h；将饱和硫酸铵沉淀之卵黄液12000r/min,4℃离心30min，去上清，加入适量pH7.4PBS溶解沉淀，-20℃保存。
1．2．3 鸡卵黄抗体（IgY）的检测
以纯化重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原为包被抗原，5.0%脱脂奶粉作封闭剂，待测鸡卵黄抗体IgY为第一抗体，辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG为第二抗体，测定IgY抗体的ELISA值（A450）。
1．2．4 双向免疫扩散实验
以双向免疫扩散法，用IgY抗体检测纯化cpa408蛋白、A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609浓缩培养上清，以生理盐水为对照。
1．2．5 酶联免疫吸附实验
用ELISA法，以IgY抗体、α毒素抗血清分别检测纯化cpa408蛋白、A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609浓缩培养上清，以生理盐水为对照，辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG及兔抗马IgG为第二抗体。
2 结果
2．1 鸡卵黄抗体检测结果
收集免疫后鸡每周所产蛋，卵黄液混合和提取后－取适量样品，ELISA间接法测定重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原鸡卵黄抗体的滴度值，结果见表1。表1 鸡卵黄抗体滴度值（略）
2．2 卵黄抗体滴度曲线
以卵黄抗体滴度为纵坐标，免疫时间为横坐标，绘制免疫后的鸡卵黄抗体的滴度曲线，见图1（略）。
2．3 双向免疫扩散实验结果
IgY孔与纯化cpa408蛋白及A型产气荚膜梭菌浓缩培养上清孔间出现特异沉淀线（箭头所指处），而与生理盐水孔间未见沉淀带,见图2（略）。
2.4 酶联免疫吸附实验结果
用鸡卵黄抗体IgY及标准抗α毒素血清同时检测纯化cpa408蛋白和A型产气荚膜梭菌NCTC64609浓缩培养上清(生理盐水为对照)，结果见表2。表2 酶联免疫吸附实验测定结果（略）
3 讨论
鸡免疫系统经cpa408蛋白免疫激活后，卵黄抗体滴度值在初次免疫后1周就达1:800，11周时达最高1:25600。而从免疫的整个过程来看，抗体滴度一般也可维持在1:6400至1:12800之间，显示cpa408蛋白具有良好的免疫原性。
然而从对鸡的整个免疫过程又可看出，初次免疫后至第5次免疫后11周时，抗体滴度从1:800增长至最高1:25600，之后就呈下降趋势。第3次免疫后到第9周抗体滴度值从1:3200增长至1:6400，这可能与第3次及第4次免疫间隔了4周时间及第3次免疫剂量仅为初次免疫剂量的1/2有关。第8周时采用与初次免疫相同剂量进行第4次免疫后，抗体滴度从1:6400增长至了1:25600，但维持时间不到1周；相同剂量第5次、第6次免疫后，抗体滴度却不再升高，提示高滴度抗体的维持不仅与抗原的免疫原性、免疫间隔时间长短、免疫剂量有关，而且还与鸡本身的年龄及状态有关，这就为制备持续且高质量的鸡卵黄抗体做了有益的尝试和探索。
鸡卵黄抗体（IgY）是来自鸡血清的IgG。在某些免疫分析中，常用鸡卵黄IgY替代哺乳类IgG。在于,与哺乳类IgG相比，鸡IgY具有不与人类补体结合，不与蛋白A结合，不与类风湿因子结合以及特异性好等免疫学特性，从而可以避免假阴性假阳性反应的出现。根据这一特点，本研究利用cpa408基因表达产物免疫SPF级30周龄产蛋鸡，制备了鸡卵黄抗体IgY。双向免疫扩散实验显示，所制备的IgY能与纯化cpa408基因表达产物及A型产气荚膜梭菌NCTC64609浓缩培养上清结合产生沉淀线；用酶联免疫吸附方法，以鸡卵黄抗体IgY及标准抗α毒素血清检测纯化cpa408蛋白及A型产气荚膜梭菌NCTC64609浓缩培养上清，所得ELISA值与阴性对照的比值均大于2.1,揭示所制备的鸡卵黄抗体IgY具有天然蛋白分子构象，可作为α毒素的检测抗体，从而为产气荚膜梭菌α毒素的检测提供了可靠的材料。
【参考文献】
1 林明辉，荫俊，王慧，等.A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因的克隆及结构分析.生命科学研究，2003，16（3）：188-191.
2 林明辉，荫俊，王慧，等.重组A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因在大肠杆菌中的高效表达.中国生物工程杂志，2003，23（12）：736.
3 林明辉，荫俊，王慧，等.重组A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原的制备及初步免疫保护作用研究.生物工程学报，2004，1：58.
4 Larsson A,Wejaker PE,Forsberg,et al.Chicken antibodies:a tool to avoid interference by complement activation in ELISA.J Immunol Methods,1992,156(1):79-83.
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6 Larsson A,S joquist J. Chicken antibodies:a tool to avoid positive resultsby rheumatoid factor in latex fixation tests.J Immunol Methods,1998,108:205-208.
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9 杨严峻，马培松，唐莉莉，等.抗大肠杆菌的IgY的分离，制备及功能性测定.食品工业科技，1997，（4）：77－79.
作者单位 ：650032 云南昆明，昆明总医院检验科
(编辑：罗彬)
(收稿日期：2005-10-24)