ACE基因多态性及大容量肺灌洗术对尘肺患者血清ACE浓度影响

    【摘要】  目的  讨论ACE基因多态性及大容量肺灌洗术（WLL）对尘肺患者血清ACE浓度的影响。方法  对71例尘肺患者在全身麻醉下行WLL治疗，灌洗前后抽取静脉血， PCR方法检测ACE基因，酶两点终点法测定ACE浓度。结果  (1)71例尘肺病患者中，ACE基因Ⅱ型者35例，占49.3％，ID型者25例，占35.2％，DD型者11例，占15.5％；146例正常对照组中Ⅱ型者68例，占46.6％，ID型者54例，占37.2％，DD型者24例，占16.2％，两组基因型频率比较差异无显著性；(2)尘肺患者WLL前血清ACE浓度为43.5±13.37u/L,较对照组31.62±9.19 u/L明显增高(P＜0.01)；(3) WLL后尘肺患者血清ACE浓度为26.74±8.71u/L，较术前明显下降，且趋于正常；(4)WLL前，ID基因型血清ACE浓度最高， DD型次之,II型最低。WLL后，DD基因型血清ACE浓度最高，ID型次之。 血清ACE浓度下降程度（△ACE）以ID型最明显，为14.28±10.66u／L,DD型次之，为9.45±6.43 u／L,II型变化最小，为 7.87±5.87 u／L(P＜0.01)。结论  ACE基因多态性影响尘肺患者血清ACE浓度；WLL后患者血清ACE浓度明显下降。

　　【关键词】  肺灌洗；　血管紧张素转换酶（ACE）；　基因多态性　；　ACE浓度

　　The effects on serum ACE concentration in the Pneumoconiosis patients by ACE gene polymorphism and WLL

　　MA Guo-xuan, LI Hong-fen, WU Shou-ling.

　　Pneumoconiosis Rehabilitation Center of State Administration of Coal Mine Safety,Qinhuangdao 066104 ,China

　　【Abstract】  Objective  Analysis the effects on serum ACE concentration in the pneumoconiosis patients by ACE gene polymorphism and WLL .Methods  71patients were performed WLL under general anesthesia ;blood samples from the vein were taken before and after WLL; polymerize chain reaction was used to detected the ACE gene, the serum ACE was measured by the way of  enzyme two points destination.Results  (1) In the 71 pneumoconiosis group ,the frequency of ACE gene II, ID, DD genotype was 49.3%, 35.2%, 15.5% respectively. In the control group, the frequency of ACE gene II, ID, DD genotype was 46.6%, 37.2%, 16.2% respectively. There was no significant difference between each genotype of the two groups. (2) Serum ACE concentration in pneumoconiosis patients before WLL were higher than that of normal people. (3) The serum ACE concentration decreased dramatically after WLL and trend to normal. (4) Before WLL,  ID geneotype  serum ACE concentration was the highest,DD genotype was second,II genotype was the lowest; after WLL,DD genotype  serum ACE concentration was the highest,ID genotype was the second; △ACE of ID geneotype is the largest, 14.28±10.66 u／L, DD geneotype is second, 9.45±6.43 u／L, II genotype was the lowest,7.87±5.87u／L(P＜0.01).Conclusion  Serum ACE concentration was affected by ACE gene polymorphism, and the serum ACE concentration decreased dramatically after WLL.

　　【Key words】  lung lavage; angiotensin converting enzyme(ACE); gene polymorphism ;  ACE concentration

　　尘肺病是由于长期吸入含游离二氧化硅（SiO2）及其他粉尘所致的、以肺组织广泛纤维化为主的全身性疾病。大容量全肺灌洗术（whole-lung lavage, WLL）是近几年逐步成熟的一种治疗尘肺病的新技术，它可清除肺泡腔和细支气管内的粉尘、吞尘肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophage,PAM）及其产生的致炎症、致纤维化因子，起到去除病因、改善呼吸功能、缓解症状的功效［1］。ACE基因多态性决定了人体内ACE浓度，而ACE是肾素－血管紧张素－醛固酮系统的关键酶，其下游产物－血管紧张素Ⅱ和醛固酮是已知的致炎和致纤维化因子［2，3］。本文旨在探讨ACE基因及WLL对尘肺患者血清ACE浓度的影响，分析了2004年71例行WLL的尘肺患者ACE基因多态性及其WLL前后血清ACE浓度变化，从基因水平进一步佐证了WLL治疗尘肺病的疗效。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料  选择本院2004年71例住院的尘肺病患者，尘肺病诊断分期依据我国《尘肺病诊断标准》GBZ70－2002。患者均为男性，年龄28～64岁，平均50.5±8.0岁；诊断分期Ⅰ期39例，Ⅰ＋10例，Ⅱ期11例，Ⅱ＋5例，Ⅲ6例；对照组为年龄、性别相匹配的146名开滦医院健康体检者，既往无肺疾患、高血压、冠心病、脑血管疾病、糖尿病、肾病等病史。

　　1.2  病例选择标准  全部病例符合WLL条件［1］：肺功能检查：肺活量(VC)、最大通气量(MVV)达到预计值70％；呼气流速峰值(PEF)、用力肺活量25％～75％的最大流速（FEF 25%～75％），第一秒时间肺活量(FEF1.0),弥散功能（DLco）均达到预计值70％；动脉血氧分压（PaO2）大于9.3 kPa (70mmHg)；心、肝、肾功能及各项化验指标均正常。

　　1.3  标本的采集与检测  WLL前抽取外周静脉血3～5ml，2％EDTA抗凝，低渗法提取白细胞，－20℃保存，酚／氯仿法提取基因组脱氧核糖核酸（DNA），PCR方法进行基因扩增，紫外灯下观察结果。WLL前及术后1周取外周静脉血2～3ml，1500r/min离心10min，取血清－80℃保存，酶两点终点法测定ACE浓度。

　　1.4  PCR方法进行基因扩增  （1）引物序列：采用PCR技术对ACE基因第16内含子目的片段进行扩增。参照文献［4］设计引物，上游引物5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′，下游引物5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′；PCR反应体系：总反应体积为25μl,其中模板DNA 0.5～1μg,TaqDNA聚合酶0.6μl(5u/μl),dNTP 2μl (2.5pmol/μl),［10X］Buffer 2.5μl,MgCl2 1.5μl,引物上、下游混合物1.6μl（2.5pmol/μl），无菌双蒸水15.8μl,应用PE-9700扩增仪进行扩增；PCR循环参数：94℃预变性240s，进入循环，94℃变性50s，58℃退火50 s，72℃延伸60s,30个循环，后延伸72℃ 300s结束反应。（2） ACE基因型判定：PCR扩增产物，以2%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化己啶染色，与Marker对照，在紫外灯下观察结果。只有一条约在490bp处出现亮带者为插入型纯合子Ⅱ型，只有一条约在190 bp处出现亮带者为缺失型纯合子DD型，两条亮带分别在490bp处和190bp处出现者为杂合子ID型（如图1）。

　　1.5  血清ACE浓度测定  采用日立（7060Automatic Analyzer）全自动生化测定仪检测。

　　1.6  WLL常规进行［1，5］。

　　1.7  统计学处理  全部资料采用EXCEL建库，分别计算各组ACE基因频率与血清ACE浓度。ACE基因型各组间频率比较采用χ2检验，血清ACE浓度测定结果以均值±标准差表示，组间数据比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析。

　　2  结果

　　2.1  尘肺患者与正常人群ACE基因I／D多态性比较  71例尘肺患者中，ACE基因Ⅱ型者35例，占49.3％，ID型者25例，占35.2％，　DD型者11例，占15.5％；146例正常对照组中ACE基因II型者68例，占46.6％，ID型者54例，占37.2％，DD型者24例，占16.2％，两组基因型频率比较差异无显著性(P＞0.05）;等位基因频率尘肺患者I:62.5%(60/96),D:37.5%(36/96)，正常对照组I:65.1%（190/292）,　D:34.9%（102/292），两组等位基因频率比较差异无显著性（P＞0.05），见表1。

　　表1  尘肺组与对照组ACE基因I／D多态性基因型和等位基因频率分布比较（略）

　　注：两组基因型频率比较P＞0.05 ,等位基因频率比较P＞0.05

　　2.2  尘肺患者与正常人群ACE浓度比较  尘肺患者血清ACE浓度为37.62±11.53u/L，对照组血清ACE浓度为31.62±9.19u/L，差异有显著性（P＜0.01）。

　　2.3  尘肺患者ACE基因多态性与血清ACE浓度关系  WLL前，ID基因型者血清ACE浓度最高，为43.5±13.37u/L，DD型者次之，为38.18±5.89u／L，II型者最低，为32.65±9.34u／L；WLL后，DD基因型者血清ACE浓度最高，为29.55±7.61u／L,ID型者次之，为28.88±11.58u／L,II型者最低，为24.26±5.68u／L。II型血清ACE浓度与ID型及DD型相比较，差异有显著性（P＜0.01），ID型与DD型血清ACE浓度比较，差异无显著（P＞0.05）；△ACE以ID型者最明显，为14.28±10.66 u／L,DD型者次之，为9.45±6.43 u／L,II型者变化最小，为7.87±5.87 u／L，差异有显著性（P＜0.01），见表2。

　　表2  不同ACE基因型尘肺患者肺灌洗前后血清ACE浓度变化比较  (略)

　　注：与WLL前比较**P＜0.01；与Ⅱ组比较△△P＜0.01，##P＜0.01，#P＜0.05

　　2.4  WLL后血清ACE浓度与术前比较  WLL后血清ACE浓度为26.74±8.71 u/L，较术前明显降低（P＜0.01）。

　　3  讨论
   
　　ACE的主要作用是催化血管紧张素Ⅰ转变为血管紧张素Ⅱ（AgⅡ），后者具有强烈收缩血管及刺激醛固酮分泌，灭活缓激肽的作用，在调节血管张力和血管平滑肌的增生中起作用。人类ACE基因第16内含子中有一段287碱基对（base pair,bp）的插入（insertion,I）和缺失(delection,D)多态性，组成II、ID、DD三种基因型。我国汉族人群ACE基因多态性的分布特征，D等位基因频率明显低于I等位基因频率［6，7］。本研究显示尘肺患者ACE基因型频率及等位基因频率与正常人群一致，均以II型最高，ID型次之，DD型最低，证明尘肺发病无ACE基因易感性而与环境因素有关。

　　血清ACE水平是由遗传决定的,ACE基因中携带D等位基者，血浆ACE浓度较高，且DD基因型血浆ACE浓度为II型的两倍，ID则介于两者之间［8，9］。本结果显示，尘肺患者I／D基因型血清ACE浓度最高，DD型次之，II型最低，与文献报道不一致。正常人群在环境因素不变的条件下,等位基因对ACE浓度起决定作用，但在病理条件（SiO2刺激）下，慢性炎性刺激对ACE浓度起主要调控作用，基因的作用变得微小，导致与正常人群不同基因型对ACE的作用结果。
   
　　1975年，Lieberman J［10］首先报道了结节病患者血清ACE活性增高，1996年，Arbustini E［11］等对61例结节患者和80例健康对照组的ACE基因进行研究，发现结节病II基因型的血清ACE水平最低，而DD型则显示最高。近年陆续有有关尘肺患者与血清ACE浓度关系的研究， Gronhagen-Riska等［12］报道矽肺患者血清ACE增高，国内学者也有相同看法。张缪佳等［13］对78例尘肺患者及24名健康对照者血清ACE活性进行了对比分析，发现尘肺患者ACE活性明显高于对照组。本研究亦显示尘肺患者血清ACE浓度明显高于对照组。尘肺血清ACE浓度增高的原因：（1）尘肺患者肺功能损害，慢性缺氧，肺血管内皮损伤，代偿性刺激血管平滑肌细胞合成ACE增多，（2）与AM ACE活性增强及肺内AM数量增多密切相关［14］。（3）ACE是由肺毛细血管内皮细胞产生并直接进入肺循环中，抗原抗体复合物刺激肺血管内皮细胞可使细胞损伤导致ACE逸出，同时也刺激肺血管内皮的增生［15］。（4）矽尘对PAM的毒性作用使其崩解死亡，崩解产生的H因子，即缓激肽和激肽刺激肺血管内皮细胞产生ACE。由于SiO2等粉尘的长期刺激，产生粉尘性或巨噬细胞性肺泡炎，进而形成肺间质纤维化，长期慢性的炎症刺激，使血清ACE水平增加，体内高水平ACE，可诱导肺内AgⅡ及醛固酮产生增多，AgⅡ不但能引起血管收缩的活性肽增加，也能引起支气管痉挛，气道平滑肌及肺血管收缩，促进微血管渗漏和气道内炎症反应，导致气道高反应，血管阻力增加而形成高血压、COPD、肺心病等病变，最后因呼衰、心衰而危及生命；同时AgⅡ可促使细胞因子PDGF-A、TGF-β、bFGF的mRNA基因表达增强［2］，促进胶原合成，促使肺纤维化形成。
   
　　WLL治疗机制是针对尘肺病理过程的肺泡炎阶段，它清除大量PAM后，对其毒性减弱，PAM功能恢复；同时清除大量SiO2粉尘，对肺部的炎性刺激作用减弱，使血清ACE浓度下降，血管紧张素Ⅱ及醛固酮分泌减少，从而使具有促成纤维细胞增殖的细胞因子（PDGF-A、TGF-β等）生成减少，可阻止或延缓肺纤维化的形成，尚可改善症状，恢复肺功能，降低心脑血管并发症，提高患者生活质量。WLL后基因调控作用恢复，ACE基因与血清ACE浓度关系恢复到正常人群的分布状态，以DD型血清ACE浓度最高，且不同基因型血清ACE浓度变化程度以WLL前ACE浓度最高的ID型下降最明显，进一步证明尘肺患者环境因素对ACE浓度影响的主导地位。WLL清除了大量粉尘及吞尘PAM，去除了病理因素的作用，降低了促使纤维化的细胞因子的生成，从基因水平进一步佐证了WLL治疗尘肺病的有效性。

　　本研究样本数尚小，观察时间短，尚需进行远期疗效的随访观察。

　　(本文图片见封三)（略）

　　【参考文献】

　　1  陈志远，张志浩，车审言.大容量全肺灌洗术医疗护理常规及操作规程.北京: 北京科技出版社， 2004，26.

　　2  木宏实.动脉硬化:细胞分子生物学ゐろ病态治疗.1994，5:45.

　　3  Song L,Wang D,Cui X,et al.Kinetic alterations of angiotensin-Ⅱ and nitric oxide in radiation pulmonary fibrosis.J Envuron Pathol Toxicol Oncol，1998，17(2)：141-150.

　　4  Rigat B,Hubert C,Corvol P, et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene(DCP1)(dipeptidyl carboxypeptidase 1).Nucleic Acids Res,1992，20:1433．

　　5  谈光新，梁云鹏，汪椿枯，等. 双肺同期大容量灌洗治疗煤工尘肺的临床研究.中国疗养医学，1998，7(4):22-26．

　　6  刘志红，陈朝红，关天俊，等.南方汉族人群中血管紧张素转换酶基因多态性的分布特征.中华医学杂志，1996,76(10):778-779.

　　7  王健军,潘颖,孙林，等.血管紧张素转换酶基因多态性与Ⅱ型糖尿病肾病.首都医科大学学报，1999,20(3):174-177.

　　8   Nakaik,Itoh C,Miura Y, et al.Deletion polymorphism of the angiotensin I-converting enzyme gene is associated with serum ACEconcentration and increased risk for CAD in the Japanese.Circulation,1994,90:2199.

　　9  Tiret L,Rigat,Visvikis S,et al.Evidence from combined segregation and linkage analysis that a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE)gene controls plasma a ACE levels.Am J Hum Gene,1992,51:197.

　　10  Lieberman J. Elevation of serum angiotensin-converting-enzyme (ACE)level in sarcoidosis.Am J med.1975，59:365-372.

　　11  Arbustini E，Grasso M,Leo G, et al.Polymorphism of angiotensin-converting enzyme gene in sarcoidois.Am J Respir Crit Care Med,1996,153(2):851-854.

　　12  Gronhagen Riskac. Angiotensin converting enzyme and Iysozynl in silicosis and abestosis . Scand J Respir Dis，1978，59:288.

　　13  张缪佳.尘肺患者血清ACE活性.南京医学院学报，1989，9(2):109.

　　14  Hinman Lui .Angiotensin Convertase activities of cigarette smoking and sarcoidosis. Science,1979,205:202.

　　15  Kumar Ashtosh .Diagnosis vale of serum angiotensin converting enzyme activity in lung disease.Thorax, 1978，31:552.

　　(编辑：邓  锋)

　　作者单位： 066104 河北秦皇岛，国家煤矿安全监察局尘肺病康复中心　      

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