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【摘要】 目的 建立体外有效扩增脐带血NKT细胞的方法及其表型的研究。方法 分别采用单加IL-2，及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺（α-Galcer）的方法，从人脐带血单个核细胞（UCB-MNCs）中扩增NKT细胞。用流式细胞检测技术测定NKT细胞（TCR Vα24+ TCR Vβ11+）的比例及其他表型特征。结果 UCB-MNCs在第7天时，其TCR Vαβ+ NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的（24.48±4.19）%，是原来的（8.74±4.37）×102倍 （ P＜0.01），且大多不表达NK1.1（CD161）；TCR Vβ11+较TCR Vα24+高表达。结论 α-Galcer对脐血NKT细胞有特异地扩增功能。以表型划分，脐血中的NKT细胞多为NK1.1-，一种新的NKT细胞亚型。
【关键词】 脐带血； NKT细胞；α-Galcer；细胞表型
The proliferation of natural killer T cells in umbilical cord blood and the different phenotype between them
LIU Yan, FAN Hua-hua, RUAN Ming,et al.Shanghai Blood Center, Shanghai 200051,China.
【Abstract】 Objective The first objective of this study was to establish an effective method to proliferate natural killer T （NKT） cells in umbilical cord blood （UCB）. The second one was to study the phenotype.Methods Mononuclear cells （MNCs） from UCB were cultured in the presence of IL-2 （100U/ml）, with or without alpha-galcer. TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells and its other phenotypes were determined by flow cytometry. Results After 7 days expansion, TCRVαβ+ NKT cells from UCB-MNCs increased（8.74±4.37）×102 times, but most of them did not express NK1.1 and its TCR Vβ11+ was higher than TCR Vα24+. Conclusion Human TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells can expand following the administration of alpha-galcer. Most of the UCB-NKT was NK1.1-, a new subset of NKT cells.
【Key words】 umbilical cord blood; natural killer T （NKT） cells; alpha-galcer; phenotype
脐带血是一种来源广泛的新资源，其中的低免疫原性细胞正日益受到人们的关注。近研究发现，构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一种新的细胞系—NKT细胞。这种细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。但是，NKT细胞在脐血中的含量极少，很难用于临床研究和治疗。本文拟探讨一种高效的体外扩增脐血NKT细胞的方法，并同时分析它的表型特征，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 Ficoll-Paque细胞分离液（Phamarcia公司）;12孔细胞培养板（Corning公司）；RPMI1640培养基（Gibico公司）；KRN7000（αlpha-galactosylceramide,简称α-Galcer，日本麒麟公司惠赠，100ng/ml）;IL-2（R&D公司）；PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体（Immunotech公司）；6%羟乙基淀粉生理盐水溶液（B.Braun公司）；EPICS ELITE ESP型流式细胞仪（Beckman-Coulter公司）。
1.2 方法
1.2.1 脐带血单个核细胞（UCB-MNCs）的制备 新鲜采集的正常人脐带血以ACD-B抗凝血袋收集，继以体积比4：1加入6%HES液中，吹打均匀后4℃下静置1h，吸取中间白膜层用0.6%ACD-PBS对倍稀释，混匀后以2：1的比例加入Ficoll上层，离心（2000rpm,20min）,取中间细胞环，PBS洗3次，悬浮于含10%FCS的完全培养液中。
1.2.2 脐带血中NKT细胞的扩增 将新鲜分离的UCB-MNCs接种于含10%FCS完全培养液的12孔细胞培养板中，每实验孔接种密度为5×105/ml，分设实验组MNCs+ IL-2（5u/ml）和MNCs+α-Galcer（100ng/ml）+ IL-2（5u/ml），并以MNCs单独培养作为空白对照组。37℃，5%CO2及饱和湿度的条件下培养。
1.2.3 形态观察 双相倒置显微镜，每12h观察细胞形态1次。
1.2.4 NKT细胞的含量及表型检测 吸取100μl培养的细胞，各加入20μl PE标记的TCR Vα24、CD161及FITC标记的TCR Vβ11单克隆抗体，避光孵育15 min，加入0.5ml PBS，做双荧光检测，测定第7天和第14天TCR Vα24+ Vβ11+ NKT细胞含量及其他表型特征。
1.3 统计学处理 采用SAS6.0统计软件作配对t检验。
2 结果
2.1 脐血NKT细胞的扩增
2.1.1 IL-2刺激单个核细胞中NKT的扩增 扩增后脐血TCR Vαβ+ NKT细胞占淋巴细胞的比例：第7天时，UCB-NKT为（0.29±0.09）%；第14天时，为（0.24±0.28）%。与MNCs单独培养组相比，脐血NKT细胞的扩增效率较原来差异无显著性（P＞0.05）。见表1。
2.1.2 α-Galcer和IL-2联合刺激单个核细胞中NKT的扩增 加用α-Galcer后，NKT的扩增效率有明显提高，占淋巴细胞的比例：第7天时，UCB-NKT为（24.48±4.19）%；第14天时为（12.15±2.02）%。尤其是培养到第7天的UCB-NKT是原来的（8.74±4.37）×102倍，与MNCs单独培养组和MNCs+ IL-2组相比，差异均有显著性（P＜0.01）。见表1。
2.1.3 形态学观察 α-Galcer+ IL-2组的脐血NKT细胞培养至4～5天出现聚集现象，第7～8天时，有聚集团出现且多漂浮，增殖明显，细胞呈大圆形或椭圆形。2周左右，部分细胞变小、萎缩。随着培养时间的延长，细胞逐渐死亡。
2.2 脐血NKT细胞的表型特征 选取TCR Vαβ+NKT细胞较多的第7天的UCB-NKT，发现脐血NKT细胞同时表达TCR Vα24和TCR Vβ11，而且后者的表达率远高于前者，在TCR Vβ11+的细胞中，CD161低表达。见图1～3。
3 讨论
已证实人类NKT细胞的数量下降或功能改变与一些自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、硬皮病中，NKT细胞的数量均较正常人有明显减少［1～3］。因此，作为细胞免疫治疗的一种途径，在体外建立一种能大量扩增NKT细胞的方法，分析它的表型特征，对于今后的临床研究及诊断治疗，都具有一定的意义。
本研究采用来源广泛的脐带血作为标本来源，利用NKT细胞可受非经典MHC-I 样分子CD1d的限制性递呈，特异性识别一些糖脂类抗原，如α-Galcer，在体外大量扩增。由于CD1d不仅表达在DC上，在NKT细胞的某一亚型，或在单个核细胞及B细胞上也有表达［4］，所以即使在抗原递呈细胞（如DC）不参与的情况下，脐血的NKT细胞（TCR Vα24+TCR Vβ11+）仍有良好的扩增效率。实验表明，单用IL-2刺激的实验组中， NKT的扩增效率与对照组相比，均无明显的改变（P＞0.05）；而加用α-Galcer后，NKT的扩增效率有明显提高（P＜0.01）。证实了IL-2虽为T细胞的增殖活化因子，但不具特异性，对NKT的扩增效果不明显；而α-Galcer确实有刺激NKT细胞扩增的作用，与文献报道一致。脐血中的NKT虽未成熟，但其本身因为已具备了与α-Galcer结合的互补配体，所以同样也表现出良好的扩增效果。
现已证明,NKT细胞有一经典的表型特征,那就是它恒定表达TCR Vα24和TCRβ11，但本实验又对其作了其他表型的流式测定。结果发现，以脐血为来源的NKT 细胞除了特异性表达TCR Vα24和TCR Vβ11外，在所有TCR Vβ11阳性细胞中，大多不表达CD161。笔者推测，这可能是NKT的另一种亚型，而且脐血NKT的TCR Vβ11+的表达率远远高于TCR Vα24+，推测NKT细胞的表型表达可能与其本身的发育成熟度有关，脐血中的NKT因尚处于细胞生成早期阶段，大多尚未成熟，TCR Vβ11是其先行表达的表型之一。
随着对NKT细胞的不断深入研究，体外有效扩增脐血NKT的方法建立为今后进一步临床研究奠定了一定的基础。但究竟其细胞表型与功能之间究竟存在着何种联系，还有待我们进一步探讨。
【参考文献】
1 Hammond KJ, Poulton LD, Palmisano LJ ,et al. alpha/beta-T cell receptor （TCR）+CD4-CD8- （NKT） thymocytes prevent insulin-dependent diabetes mellitus in nonobese diabetic （NOD）/Lt mice by the influence of interleukin （IL）-4 and/or IL-10.J Exp Med, 1998, 187:1047-1056.
2 Wilson SB,Kent SC,Patton KT, et al. Extreme TH1 bias of invariant V alpha 24J alpha Q T cells in type 1 diabetes.Nature,1998,391（6663）:177.
3 Zeng D,Lewis D,Defbakhsh-Jones S,et al.Bone marrow NK1.1（-） and NK1.1（+） T cells reciprocally regulate acute graft-versus-host disease.J Exp Med,1999,189（7）:1073.
4 Ueda Y, Hagihara M, Gansuvd B, et al. The effects of alphaGalCer-induced TCRValpha24 Vbeta11（+） natural killer T cells on NK cell cytotoxicity in umbilical cord blood.Cancer Immunol Immunother, 2003, 52:625-631.
基金项目：上海市卫生局青年科研基金资助项目（034y34）
作者单位： 200051 上海，上海市血液中心血液工程研究室