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【摘要】 目的 探讨超抗原SEB（staphylococcal enterotoxin B）诱导的抗排斥反应作用中CD4+CD16+ NKT细胞作用。方法 Lewis大鼠作为受体，F344大鼠作为供体。实验受体鼠在角膜移植前7天用缝线法处理角膜，建立高危角膜移植的模型。高危受体大鼠被随机分成7组，移植前5个实验组大鼠腹腔分别注射0.2ml不同浓度的SEB 25、50、75、100μg/kg和50μg/kg SEB并结膜下注射地塞米松0.1ml(2.0mg/ml),每天1次,连续7天。异种移植对照组腹腔注射0.2ml生理盐水；同种移植对照组为（Lewis对 Lewis大鼠）角膜移植。术后用裂隙灯显微镜观察记录角膜移植片的浑浊、水肿和新生血管指标，以移植排斥反应指数RI判断移植后存活天数；混合淋巴细胞培养（MRL）和迟发型过敏反应判断淋巴细胞对异原性抗原的反应能力和反应细胞，用流式细胞技术检测CD4+T、CD8+T和CD4+CD16+NKT细胞亚群数量，用ELISA方法检查IL-2、IL-10的水平。结果 腹腔注射50、75μg/kg SEB组的大鼠，移植片分别存活了10.7天和12.5天，比移植对照组延长时间3～5天（P≤0.05）；75μg/kg SEB组大鼠的淋巴细胞与ConA和外源性抗原的反应性分别由A值1.51下降到0.64和从0.83下降到0.47，并伴随迟发型过敏反应能力下降。在脾脏、下颌淋巴结中随移植片存活时间延长CD4+T、CD8+T细胞数量减少，CD4+CD16+NKT细胞数量明显增加。当SEB与糖皮质激素共同使用时，抗排斥反应作用消失，NKT细胞数量也随之下降，NKT细胞的增加伴随IL-2的降低和IL-10的增加。结论 超抗原SEB能活化NKT细胞并使高危角膜移植后移植片生存时间的延长。SEB诱导的抗排斥作用与全身性降低CD4+T、CD8+T细胞的数量和增加CD4+CD16+NKT细胞的数量有关；SEB活化的CD4+CD16+NKT细胞可能是Th2偏移的细胞，它们与IL-10共同参与了SEB诱导的免疫耐受和抗排斥作用。
【关键词】 超抗原； NKT细胞； 免疫耐受； 角膜移植
The role of staphylococcal enterotoxin B (SEB)-activating NKT cells on anti-rejection
CHEN Yu, JIE Ying, PAN Zhi-qiang，et al.
Department of Immunology, General Hospital of PLA, Beijing 100853,China
【Abstract】 Objective A role of SEB-activating NKT cells on anti-rejection of high-risk rat corneal transplantation was investigated.Methods Lewis (recipients) and F344 (donors) rats were used in this study. A high-risk rat model of corneal transplantation was performed by surgery in recipients on day 7 prior to the experiments. The 7 recipient groups included the rats treated by peritoneal injections of SEB at the doses of 25, 50, 75 and 100μg/kg. Controls were grouped in the rats receiving saline alone, SEB (50μg/kg) with glucocorticoid (2.0mg/ml. in 0.1ml), and a self-corneal graft. Survival time of graft was recorded using the anti-rejection index method (RI) by scoring opacity, edema and neovascularization. The lymphocyte responses to ConA and alloantigen were examined using MRL. Delayed hypersensitivity (DTH) and frequency in subtypes of lymphocytes were determined using flow cytometry. IL-2 and IL-10 in aqueous humor and serum from the recipients were detected using ELISA.Results The corneal grafts were able to survive for about 10 and 13 days in the recipients treated with the SEB (50 and 75μg/kg). The survival time in the treated recipients was obviously prolonged for 3-5 days as compared with that of the controls (P≤0.05). A values in the lymphocyte responses to ConA and alloantigens were respectively reduced from 1.51 and 0.83 to 0.63 and to 0.47 with a decreased DTH in the recipients treated with the SEB of 75μg/kg. The frequency of CD4+ and CD8+T cells was decreased with an enhanced population of CD4+CD16+ NKT cells in spleen, peripheral blood and submandibular gland from the recipients. In an association with glucocorticoid used, not only the survival time of allograft in the recipients treated by SEB did not prolong but also CD4+CD16+ NKT cells were decreased. In addition, a low IL-2 and a high IL-10 may be observed in serum and equeous humor from the treated recipients.Conclusion SEB can activates CD4+CD16+ NKT cells and contributes to the reaction of anti-rejection of corneal transplantation in the high-risk rat model. The CD4+CD16+ NKT cells by SEB-activated may be Th2 polarization and lead to the state of anergy in recipients with high level IL-10.
【Key words】 superantigen； NKT cell； immune intolerance;corneal transplantation；
NKT细胞是免疫系统中第四类淋巴细胞［1］，它们是一群独立的细胞群。这些细胞表面既带有T细胞的TcR α β的表面标志又带有NK细胞的NK1.1抗原的表面标志。以往的研究指出NKT细胞可能有异质性，它们在免疫应答反应中显示多方面的作用，如参与免疫系统的抗肿瘤、抗感染作用，克服移植的排斥反应以及控制自身免疫病的发生和发展。有证据显示NKT细胞的调节功能大于效应功能［2，3］ 。到目前为止大部分的研究已经报道NKT细胞是由特异性抗原半乳糖神经酰胺（alpha-galactosylceramide,简称α-galcer）通过类似于MHC I类抗原的CD1d分子递呈而被活化的。笔者以往的研究发现在小鼠外周淋巴细胞移植、骨髓移植和大鼠角膜移植中使用SEB可以诱导动物体的耐受形成，显示出抗排斥作用［4，5］。本研究建立了高危大鼠模型，在此基础上进行了MHC遗传背景不同的大鼠间角膜移植。用金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B,SEB）作为耐受原研究了SEB诱导的抗排斥效应以及耐受形成中NKT的重要作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
64只Lewis大鼠作为受体，30只F344大鼠作为供体。供、受体大鼠均为雌性，体重160～180g，周龄为8～10周，均购自中国医学科学院实验动物中心。角膜移植实验均在首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心三级动物室完成。超抗原SEB购自军事医学科学院五所，ConA购自Sigma公司，抗CD4-FITC、抗CD8-PE、抗CD16 1a-PE荧光抗体均购自BD公司，地塞米松购自江苏扬州制药厂，胎牛血清（FCS）及RPMI1640培养基（Gibco公司）、ConA（中山生物试剂公司），测定大鼠IL-2、IL-10水平的ELISA试剂盒购自美国PIERCE ENDOGEN公司。
1.2 大鼠高危角膜移植动物模型的建立
用缝线法诱导受体大鼠（Lewis）角膜新生血管。7天后选择新生血管均匀长入角膜中同区的大鼠作为受体鼠。角膜移植参照Williams等［4］的方法，施行穿透性角膜移植术。
1.3 SEB的注射方法
实验分为7个组，5个实验组和2个对照组。移植前5个实验组大鼠腹腔分别注射0.2ml不同浓度的SEB 25、50、75、100μg/kg和50μg/kg SEB并结膜下注射地塞米松0.1ml(2.0mg/ml),每天1次,连续7天。异种移植对照组腹腔注射0.2ml生理盐水；同种移植对照组为（Lewis对 Lewis大鼠）角膜移植。
1.4 移植片存活天数的记录方法
用排斥指数RI记录排斥发生的时间，即术后用裂隙灯显微镜追踪观察记录角膜移植片的浑浊、水肿和新生血管指标，三项指标之和为排斥指数即 RI，当RI值大于等于5.0时，视为角膜移植排斥反应发生［6］。
1.5 混合淋巴细胞培养（MLR）测定淋巴细胞应答反应能力
在角膜移植后的第10天，分别取实验组大鼠和对照组大鼠的脾脏，制备成5×106个细胞/ ml的悬液，加到96孔培养板中，每孔加0.1ml。刺激原为5μg/ml ConA和供体鼠F344大鼠的脾细胞。脾细胞悬液为5×106个细胞/ml，置-20℃ 1～2h后，离心2000转/min×20min，收集细胞碎片，使用时用RPMI1640培养基恢复到原体积。刺激原分别取0.1ml加入含有受体大鼠脾细胞的培养板中，37℃5%CO2条件下培养3天，加MTT（四甲基偶氮唑盐，50mgMTT溶于10mlPBS中过滤除菌），于570nm波长测定A值，记录受体鼠淋巴细胞增殖。
1.6 迟发性超敏反应DTH检测T细胞的应答反应性
角膜移植后第10天，分别测量并记录移植对照组和SEB75μg/kg组大鼠下肢脚掌的厚度。取供体大鼠F344的脾脏制备或细胞悬液，并用60Co照射2000Rad，30min，分别注射给两组大鼠的右脚掌1×107个脾细胞（50μl）；左脚掌注射50μl生理盐水。24h后游标卡尺再次别测量各大鼠两下肢脚掌厚度。根据公式记录脚掌膨胀度：
脚掌膨胀度=［（24h-0h）实验脚-（24-0h）对照脚］×10-3mm
1.7 流式细胞仪检测外周组织中淋巴细胞亚群数量
角膜移植后第10天，分别取不同组受体鼠的脾细胞、下颌腺淋巴结细胞及外周血淋巴细胞1×106个，分别用抗CD4-FITC、CD8-PE和抗CD16 1a-PE荧光抗体染色，用FACS Calibue（BD，USA）仪器测定，记取细胞10000个，分析CD4+、CD8+、CD4+CD16+淋巴细胞亚群的阳性表达率。
1.8 房水和外周血中细胞因子的测定
术后第10天，取不同组别受体鼠房水（10倍稀释后使用）和血清样本0.1ml加入预先用IL-2和IL-10抗体包被的96孔板中，每份样品及标准品均一式3孔。按美国PIERCRCE ENDOGEN公司提供的试剂盒说明书方法作ELISA检测，并分别以450nm和550nm波长测定IL-2、IL-10的吸光度值（A），根据试剂盒标准曲线计算出样品IL-2和IL-10的细胞因子浓度。
2 结 果
2.1 SEB延长移植片的存活天数
选择性缝线处理和穿透性角膜移植术后健康存活的大鼠为观察对象，并记录存活时间。表1 的结果显示与同种移植对照组相比除25μg/kg组外， SEB 50、75、100μg/kg组大鼠移植片的存活时间均明显延长（P＜0.05）；其中75μg/kg组效果最明显，移植片比对照组延长了5天，达到12.5天。4只同系移植的对照组大鼠移植片均未发生排斥反应，均存活了30天以上（见表1）。
表1 不同实验组异系间角膜移植片存活天数（略）
2.2 SEB降低受体淋巴细胞应答反应能力（MRL）
角膜移植前后注射了SEB的大鼠，在角膜移植后的第10天，取大鼠脾细胞与ConA(5ug/ml)和供体脾细胞做单向混合淋巴细胞培养。结果显示使用SEB的各组大鼠其外周淋巴细胞对ConA和供体淋巴细胞的反应能力均有不同程度的降低，75μg/kg组大鼠的反应性最低，A值由正常的0.83下降到0.47(见表2)。
2.3 SEB抑制受体T淋巴细胞的应答反应能力（DTH）
选择移植片存活时间最长的75μg/kg组和移植对照组大鼠在接受角膜移植后的第10天做迟发性过敏反应实验（DTH）。表3的结果显示对照组和75μg/kg组0h和24h脚掌厚度，经DTH脚掌膨胀度计算，对照组为84.6×10-3mm, SEB75μg/kg组为12.5×10-3mm，实验组T细胞的应答反应能力明显降低。
表2 受体淋巴细胞对ConA 和供体脾细胞的应（略）
注：与移植对照组相比，★P≤0.01
表3 SEB75μg/kg组和对照组DTH反应强度的比较（略）
经计算对照组脚掌膨胀度为84.6×10-3mm，SEB75μg/kg组为：12.5×10-3mm。
2.4 SEB对受体鼠淋巴细胞亚群的影响
角膜移植术后第10天，用流式细胞技术测定各组大鼠脾细胞、下颌腺淋巴细胞中CD4+T、CD8+T和CD4+CD16+NKT细胞的百分数。结果显示移植前后使用SEB50、75μg/kg的大鼠外周组织中CD4+T、CD8+T细胞数量减少；CD4+CD16+NKT细胞的数量随CD4+T、CD8+T细胞数量的减少而增加（见表4）。
表4 受体外周器官淋巴细胞亚群构成比（略）
注：与移植对照组相比，★P≤0.01，recipients(n=2)
2.5 NKT细胞参与SEB诱导的抗排斥作用
在角膜移植中使用50μg/kg SEB的同时结膜下注射0.1ml地塞米松(2.0mg/ml)。结果显示单独使用SEB可以延长移植片存活时间2～3天，大鼠的脾、下颌腺和外周血中NKT细胞数量大幅增加；使用地塞米松后，SEB的抗排斥作用消失，NKT细胞数量明显减少到低于正常组（见表5）。
2.6 SEB对受体鼠代谢产物的影响
用ELISA方法检查术后第10天各组大鼠房水和血清中IL-2和IL-10水平，结果显示出与对照组大鼠相比，SEB实验组大鼠的IL-2水平明显降低，IL-10水平明显增加。其中抗排斥能力最好的SEB75μg/kg组大鼠的IL-2水平低于对照组约4倍，IL-10水平高于对照组约2倍以上（见表6）。
表5 NKT细胞百分数与移植片存活天数比较（略）
表6 受体组大鼠房水和血清中细胞因子的浓度(pg/ml)（略）
注：与移植对照组相比，★P≤0.01
3 讨论
NKT细胞是一群表达NK1.1+TcRαβ+抗原的淋巴细胞亚群，最初是在那些NK1.1+的小鼠中发现,2000年被命名为第四类的淋巴细胞。小鼠的NKT细胞主要是CD4+或者CD4-、CD8-细胞［1、7］。大量的NKT细胞存在于肝脏，大约占T淋巴细胞的30%，外周血、脾脏中很少只占2%前后［8］ 。NKT细胞的作用主要有两个方面，效应功能和调节功能；它可以抑制Th1细胞的过激，控制IL-2、IFN-γ的产生和后期的细胞增殖，可以调节Th2细胞的细胞因子产生，使T细胞分化朝Th2方向偏移；它也可以在Th1细胞抵抗感染和肿瘤时提供帮助以及可以阻止部分细胞的分化，控制自身免疫病的发生和发展［9］。NKT细胞的活化主要依靠类脂多肽类抗原如半乳糖神经酰胺（alpha-galactosylceramide,简称α-galcer）和类似于MHC I类抗原的CD1d递呈抗原。目前还无法证明其他脂类或糖脂类抗原能否激活NKT细胞，并使其发挥功能。笔者以往的研究发现葡萄球菌肠毒素B（SEB）作为耐受原不仅能诱导淋巴细胞的耐受［4］ ，在异基因骨髓移植、皮肤移植和角膜移植中都显示出明显抗排斥效应［10、11］ ，而所有耐受特征和抗排斥作用都伴随NKT细胞的增加。尽管在角膜移植中使用SEB能使角膜移植片成功存活25天以上［5］ ，但是因为角膜是赦免部位（immune privileged site），它们通常与免疫系统隔离，角膜移植中由于角膜缺乏血管和淋巴管，淋巴细胞不易进入角膜，因此不易发生排斥反应，是成功率最高的器官移植。如果眼屏障被打破，淋巴细胞就可以进入眼内，排斥反应将加剧。为了研究SEB在高危角膜移植中的抗排斥效应和耐受形成中NKT细胞的重要作用，本文使用了角膜移植前用缝线法处理成血管增生的高危状态的大鼠，在遗传背景不同的大鼠间进行角膜移植的前后给受体鼠腹腔注射了25μg、50μg、75μg 和100μg /kg SEB并检查了SEB诱导的抗排斥作用和耐受形成的细胞学特征。这些结果显示，在角膜移植中使用适量的SEB（ 50ug、75μg/kg）可以使移植片的存活时间延长到10.70天到12.5天，比移植对照组长3～5天（P≤0.05，表1）。用这些获得了抗排斥能力的受体鼠的淋巴细胞与ConA或同种异体大鼠的淋巴细胞反应，其应答反应能力下降，A值分别由1.51下降到0.64和从0.83下降到0.47（表2）；与对照组相比，迟发型过敏反应（DTH）能力降低了约8倍（表3）。DTH反应性降低通常与角膜移植片长期存活和眼前房免疫偏位（anterior chamber-associated immuned deviation, ACAID）有关；ACAID是显示动物外周免疫系统耐受的指标，它破坏Th1细胞的应答反应，介导向Th2细胞偏移［12］。另外，在具有抗排斥能力的受体鼠中，随移植片存活时间的延长，CD4+T、CD8+T细胞数量减少， CD4+CD16+NKT细胞数量在脾脏和下颌腺中明显增加（表4，P≤0.05）,显示出SEB诱导的抗排斥作用与NKT细胞的大量存在有关。为了证明SEB活化的NKT细胞参与了SEB诱导的抗排斥作用，在角膜移植时同时使用地塞米松和SEB。表5的结果证明单独使用SEB可以使移植片存活时间延长并伴随CD4+CD16+NKT细胞的大幅增加；但地塞米松和SEB同时使用后，移植片不能存活，CD4+CD16+NKT细胞数量也明显低于正常值（表5）。这个结果表明能够活化NKT细胞的抗原除了α-galcer，SEB同样能够活化NKT细胞；活化了的NKT细胞具有生物功能，它们参与了机体的耐受性调节并在角膜移植中起到了抗排斥作用。SEB活化的NKT细胞是CD4+NKT细胞而不是CD4-NKT细胞［13，14］，因为它们分泌大量的IL-10 （表6）并很有可能介导了细胞向Th2细胞偏移。
本研究证明了SEB在高危角膜移植中诱导的抗排斥作用与NKT细胞的参与有关；并且证明了能够活化NKT细胞的抗原不限于α-galcer，SEB同样诱导出大量的CD4+CD16+NKT细胞。这些NKT细胞直接参与了SEB诱导抗排斥作用和耐受性调节，并有可能参与了促进了T细胞朝Th2细胞分化的过程。
【参考文献】
1 Taniguchi M. A novel lymphocyte—NKT. JSI Newsletter, 2000,8(1):15-16.
2 Seino KI, Fukao K, Muramoto K, et al. Requirement fot natural killer T(NKT) cells in the induction of allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98:2577.
3 Smyth MJ, Godfrey DI. NKT cell and tumor immunity-a double-edged sword. Nat Immunol, 2000,1:459.
4 陈钰，彭虹，尉承泽，等.超抗原SEB在同种异体细胞移植小鼠中诱导的免疫耐受极其特征.细胞与分子免疫学杂志，2002，18（2）：101-103.
5 Zhiqiang Pan, Yu Chen, Wenhua Zhang, et al. Rat corneal allograft survival proloned by the superantigen staphylococcal enterotoxin B. Invest Ophtbalmol Vis Sci， 2003,44:3346.
6 Williams KA, Coster DJ. Penetrating corneal tranplantation in the inbred rat: a new model. Invest Ophthalmol Vis. Sci， 1985,26:23-30.
7 Macdonald HR. NK1.1+T cell receptor-α/β+cells: New clues to their origin, spicifity,and function. J Exp Med， 1995,182:633.
8 Luc Van Laer. Regulation of immune responses by CD1d-restricted nature killer T cells. Immunologic Research， 2004,30(2):139-153.
9 Lucis B, Veronique L, Jan N, et al. NKT cells inhibit the onset of diabetes by impairing the development of pathogenic T cells specific for pancreatic βcells.
Immunity,2002,17:725-736.
10 接英，潘志强，陈钰，等.SEB诱导的免疫耐受治疗大鼠高危角膜移植的实验研究.中华眼科杂志，2005， 41(2):150-155.
11 陈钰，潘志强，彭虹，等.在小鼠异基因骨髓细胞移植中超抗原SEB诱导的耐受特征.细胞与分子免疫学杂志，2005， 21（5）：544-547.
12 Nakamura T, Terajewicz A, Stein-Streilein J. Mechanisms of Peripheral Tolerance following Intracameral Inoculation Are Independent of IL-13 or STAT6. J Immunol，2005，Aug15;175(4):2643-2646.
13 Sonoda KH, Stein-streilein J. Ocular immune privilege and CD1d-reative natural killer T cells. Cornea, 2002,21(2):33-38.
14 中村隆彦，园田康平,石桥达朗，等.ACAID诱导には通常のCD4阳性NKT细胞でなくCD4阳性NKT胞が必须である.Proceedings of the Japanese Society for Immunology(JSI), 2004，34:135.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30271385）
作者单位： 100853 北京，解放军总医院免疫学教研室
100730 北京，首都医科大学附属北京同仁医院，北京同仁医院眼科中心，北京眼科研究所
(编辑：余 强)
【摘要】 目的 探讨超抗原SEB（staphylococcal enterotoxin B）诱导的抗排斥反应作用中CD4+CD16+ NKT细胞作用。方法 Lewis大鼠作为受体，F344大鼠作为供体。实验受体鼠在角膜移植前7天用缝线法处理角膜，建立高危角膜移植的模型。高危受体大鼠被随机分成7组，移植前5个实验组大鼠腹腔分别注射0.2ml不同浓度的SEB 25、50、75、100μg/kg和50μg/kg SEB并结膜下注射地塞米松0.1ml(2.0mg/ml),每天1次,连续7天。异种移植对照组腹腔注射0.2ml生理盐水；同种移植对照组为（Lewis对 Lewis大鼠）角膜移植。术后用裂隙灯显微镜观察记录角膜移植片的浑浊、水肿和新生血管指标，以移植排斥反应指数RI判断移植后存活天数；混合淋巴细胞培养（MRL）和迟发型过敏反应判断淋巴细胞对异原性抗原的反应能力和反应细胞，用流式细胞技术检测CD4+T、CD8+T和CD4+CD16+NKT细胞亚群数量，用ELISA方法检查IL-2、IL-10的水平。结果 腹腔注射50、75μg/kg SEB组的大鼠，移植片分别存活了10.7天和12.5天，比移植对照组延长时间3～5天（P≤0.05）；75μg/kg SEB组大鼠的淋巴细胞与ConA和外源性抗原的反应性分别由A值1.51下降到0.64和从0.83下降到0.47，并伴随迟发型过敏反应能力下降。在脾脏、下颌淋巴结中随移植片存活时间延长CD4+T、CD8+T细胞数量减少，CD4+CD16+NKT细胞数量明显增加。当SEB与糖皮质激素共同使用时，抗排斥反应作用消失，NKT细胞数量也随之下降，NKT细胞的增加伴随IL-2的降低和IL-10的增加。结论 超抗原SEB能活化NKT细胞并使高危角膜移植后移植片生存时间的延长。SEB诱导的抗排斥作用与全身性降低CD4+T、CD8+T细胞的数量和增加CD4+CD16+NKT细胞的数量有关；SEB活化的CD4+CD16+NKT细胞可能是Th2偏移的细胞，它们与IL-10共同参与了SEB诱导的免疫耐受和抗排斥作用。
【关键词】 超抗原； NKT细胞； 免疫耐受； 角膜移植
【中图分类号】 R392-33
The role of staphylococcal enterotoxin B (SEB)-activating NKT cells on anti-rejection
CHEN Yu, JIE Ying, PAN Zhi-qiang，et al.
Department of Immunology, General Hospital of PLA, Beijing 100853,China
【Abstract】 Objective A role of SEB-activating NKT cells on anti-rejection of high-risk rat corneal transplantation was investigated.Methods Lewis (recipients) and F344 (donors) rats were used in this study. A high-risk rat model of corneal transplantation was performed by surgery in recipients on day 7 prior to the experiments. The 7 recipient groups included the rats treated by peritoneal injections of SEB at the doses of 25, 50, 75 and 100μg/kg. Controls were grouped in the rats receiving saline alone, SEB (50μg/kg) with glucocorticoid (2.0mg/ml. in 0.1ml), and a self-corneal graft. Survival time of graft was recorded using the anti-rejection index method (RI) by scoring opacity, edema and neovascularization. The lymphocyte responses to ConA and alloantigen were examined using MRL. Delayed hypersensitivity (DTH) and frequency in subtypes of lymphocytes were determined using flow cytometry. IL-2 and IL-10 in aqueous humor and serum from the recipients were detected using ELISA.Results The corneal grafts were able to survive for about 10 and 13 days in the recipients treated with the SEB (50 and 75μg/kg). The survival time in the treated recipients was obviously prolonged for 3-5 days as compared with that of the controls (P≤0.05). A values in the lymphocyte responses to ConA and alloantigens were respectively reduced from 1.51 and 0.83 to 0.63 and to 0.47 with a decreased DTH in the recipients treated with the SEB of 75μg/kg. The frequency of CD4+ and CD8+T cells was decreased with an enhanced population of CD4+CD16+ NKT cells in spleen, peripheral blood and submandibular gland from the recipients. In an association with glucocorticoid used, not only the survival time of allograft in the recipients treated by SEB did not prolong but also CD4+CD16+ NKT cells were decreased. In addition, a low IL-2 and a high IL-10 may be observed in serum and equeous humor from the treated recipients.Conclusion SEB can activates CD4+CD16+ NKT cells and contributes to the reaction of anti-rejection of corneal transplantation in the high-risk rat model. The CD4+CD16+ NKT cells by SEB-activated may be Th2 polarization and lead to the state of anergy in recipients with high level IL-10.
【Key words】 superantigen； NKT cell； immune intolerance;corneal transplantation；
NKT细胞是免疫系统中第四类淋巴细胞［1］，它们是一群独立的细胞群。这些细胞表面既带有T细胞的TcR α β的表面标志又带有NK细胞的NK1.1抗原的表面标志。以往的研究指出NKT细胞可能有异质性，它们在免疫应答反应中显示多方面的作用，如参与免疫系统的抗肿瘤、抗感染作用，克服移植的排斥反应以及控制自身免疫病的发生和发展。有证据显示NKT细胞的调节功能大于效应功能［2，3］ 。到目前为止大部分的研究已经报道NKT细胞是由特异性抗原半乳糖神经酰胺（alpha-galactosylceramide,简称α-galcer）通过类似于MHC I类抗原的CD1d分子递呈而被活化的。笔者以往的研究发现在小鼠外周淋巴细胞移植、骨髓移植和大鼠角膜移植中使用SEB可以诱导动物体的耐受形成，显示出抗排斥作用［4，5］。本研究建立了高危大鼠模型，在此基础上进行了MHC遗传背景不同的大鼠间角膜移植。用金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B,SEB）作为耐受原研究了SEB诱导的抗排斥效应以及耐受形成中NKT的重要作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
64只Lewis大鼠作为受体，30只F344大鼠作为供体。供、受体大鼠均为雌性，体重160～180g，周龄为8～10周，均购自中国医学科学院实验动物中心。角膜移植实验均在首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心三级动物室完成。超抗原SEB购自军事医学科学院五所，ConA购自Sigma公司，抗CD4-FITC、抗CD8-PE、抗CD16 1a-PE荧光抗体均购自BD公司，地塞米松购自江苏扬州制药厂，胎牛血清（FCS）及RPMI1640培养基（Gibco公司）、ConA（中山生物试剂公司），测定大鼠IL-2、IL-10水平的ELISA试剂盒购自美国PIERCE ENDOGEN公司。
1.2 大鼠高危角膜移植动物模型的建立
用缝线法诱导受体大鼠（Lewis）角膜新生血管。7天后选择新生血管均匀长入角膜中同区的大鼠作为受体鼠。角膜移植参照Williams等［4］的方法，施行穿透性角膜移植术。
1.3 SEB的注射方法
实验分为7个组，5个实验组和2个对照组。移植前5个实验组大鼠腹腔分别注射0.2ml不同浓度的SEB 25、50、75、100μg/kg和50μg/kg SEB并结膜下注射地塞米松0.1ml(2.0mg/ml),每天1次,连续7天。异种移植对照组腹腔注射0.2ml生理盐水；同种移植对照组为（Lewis对 Lewis大鼠）角膜移植。
1.4 移植片存活天数的记录方法
用排斥指数RI记录排斥发生的时间，即术后用裂隙灯显微镜追踪观察记录角膜移植片的浑浊、水肿和新生血管指标，三项指标之和为排斥指数即 RI，当RI值大于等于5.0时，视为角膜移植排斥反应发生［6］。
1.5 混合淋巴细胞培养（MLR）测定淋巴细胞应答反应能力
在角膜移植后的第10天，分别取实验组大鼠和对照组大鼠的脾脏，制备成5×106个细胞/ ml的悬液，加到96孔培养板中，每孔加0.1ml。刺激原为5μg/ml ConA和供体鼠F344大鼠的脾细胞。脾细胞悬液为5×106个细胞/ml，置-20℃ 1～2h后，离心2000转/min×20min，收集细胞碎片，使用时用RPMI1640培养基恢复到原体积。刺激原分别取0.1ml加入含有受体大鼠脾细胞的培养板中，37℃5%CO2条件下培养3天，加MTT（四甲基偶氮唑盐，50mgMTT溶于10mlPBS中过滤除菌），于570nm波长测定A值，记录受体鼠淋巴细胞增殖。
1.6 迟发性超敏反应DTH检测T细胞的应答反应性
角膜移植后第10天，分别测量并记录移植对照组和SEB75μg/kg组大鼠下肢脚掌的厚度。取供体大鼠F344的脾脏制备或细胞悬液，并用60Co照射2000Rad，30min，分别注射给两组大鼠的右脚掌1×107个脾细胞（50μl）；左脚掌注射50μl生理盐水。24h后游标卡尺再次别测量各大鼠两下肢脚掌厚度。根据公式记录脚掌膨胀度：
脚掌膨胀度=［（24h-0h）实验脚-（24-0h）对照脚］×10-3mm
1.7 流式细胞仪检测外周组织中淋巴细胞亚群数量
角膜移植后第10天，分别取不同组受体鼠的脾细胞、下颌腺淋巴结细胞及外周血淋巴细胞1×106个，分别用抗CD4-FITC、CD8-PE和抗CD16 1a-PE荧光抗体染色，用FACS Calibue（BD，USA）仪器测定，记取细胞10000个，分析CD4+、CD8+、CD4+CD16+淋巴细胞亚群的阳性表达率。
1.8 房水和外周血中细胞因子的测定
术后第10天，取不同组别受体鼠房水（10倍稀释后使用）和血清样本0.1ml加入预先用IL-2和IL-10抗体包被的96孔板中，每份样品及标准品均一式3孔。按美国PIERCRCE ENDOGEN公司提供的试剂盒说明书方法作ELISA检测，并分别以450nm和550nm波长测定IL-2、IL-10的吸光度值（A），根据试剂盒标准曲线计算出样品IL-2和IL-10的细胞因子浓度。
2 结 果
2.1 SEB延长移植片的存活天数
选择性缝线处理和穿透性角膜移植术后健康存活的大鼠为观察对象，并记录存活时间。表1 的结果显示与同种移植对照组相比除25μg/kg组外， SEB 50、75、100μg/kg组大鼠移植片的存活时间均明显延长（P＜0.05）；其中75μg/kg组效果最明显，移植片比对照组延长了5天，达到12.5天。4只同系移植的对照组大鼠移植片均未发生排斥反应，均存活了30天以上（见表1）。
表1 不同实验组异系间角膜移植片存活天数（略）
2.2 SEB降低受体淋巴细胞应答反应能力（MRL）
角膜移植前后注射了SEB的大鼠，在角膜移植后的第10天，取大鼠脾细胞与ConA(5ug/ml)和供体脾细胞做单向混合淋巴细胞培养。结果显示使用SEB的各组大鼠其外周淋巴细胞对ConA和供体淋巴细胞的反应能力均有不同程度的降低，75μg/kg组大鼠的反应性最低，A值由正常的0.83下降到0.47(见表2)。
2.3 SEB抑制受体T淋巴细胞的应答反应能力（DTH）
选择移植片存活时间最长的75μg/kg组和移植对照组大鼠在接受角膜移植后的第10天做迟发性过敏反应实验（DTH）。表3的结果显示对照组和75μg/kg组0h和24h脚掌厚度，经DTH脚掌膨胀度计算，对照组为84.6×10-3mm, SEB75μg/kg组为12.5×10-3mm，实验组T细胞的应答反应能力明显降低。
表2 受体淋巴细胞对ConA 和供体脾细胞的应（略）
注：与移植对照组相比，★P≤0.01
表3 SEB75μg/kg组和对照组DTH反应强度的比较（略）
经计算对照组脚掌膨胀度为84.6×10-3mm，SEB75μg/kg组为：12.5×10-3mm。
2.4 SEB对受体鼠淋巴细胞亚群的影响
角膜移植术后第10天，用流式细胞技术测定各组大鼠脾细胞、下颌腺淋巴细胞中CD4+T、CD8+T和CD4+CD16+NKT细胞的百分数。结果显示移植前后使用SEB50、75μg/kg的大鼠外周组织中CD4+T、CD8+T细胞数量减少；CD4+CD16+NKT细胞的数量随CD4+T、CD8+T细胞数量的减少而增加（见表4）。
表4 受体外周器官淋巴细胞亚群构成比（略）
注：与移植对照组相比，★P≤0.01，recipients(n=2)
2.5 NKT细胞参与SEB诱导的抗排斥作用
在角膜移植中使用50μg/kg SEB的同时结膜下注射0.1ml地塞米松(2.0mg/ml)。结果显示单独使用SEB可以延长移植片存活时间2～3天，大鼠的脾、下颌腺和外周血中NKT细胞数量大幅增加；使用地塞米松后，SEB的抗排斥作用消失，NKT细胞数量明显减少到低于正常组（见表5）。
2.6 SEB对受体鼠代谢产物的影响
用ELISA方法检查术后第10天各组大鼠房水和血清中IL-2和IL-10水平，结果显示出与对照组大鼠相比，SEB实验组大鼠的IL-2水平明显降低，IL-10水平明显增加。其中抗排斥能力最好的SEB75μg/kg组大鼠的IL-2水平低于对照组约4倍，IL-10水平高于对照组约2倍以上（见表6）。
表5 NKT细胞百分数与移植片存活天数比较（略）
表6 受体组大鼠房水和血清中细胞因子的浓度(pg/ml)（略）
注：与移植对照组相比，★P≤0.01
3 讨论
NKT细胞是一群表达NK1.1+TcRαβ+抗原的淋巴细胞亚群，最初是在那些NK1.1+的小鼠中发现,2000年被命名为第四类的淋巴细胞。小鼠的NKT细胞主要是CD4+或者CD4-、CD8-细胞［1、7］。大量的NKT细胞存在于肝脏，大约占T淋巴细胞的30%，外周血、脾脏中很少只占2%前后［8］ 。NKT细胞的作用主要有两个方面，效应功能和调节功能；它可以抑制Th1细胞的过激，控制IL-2、IFN-γ的产生和后期的细胞增殖，可以调节Th2细胞的细胞因子产生，使T细胞分化朝Th2方向偏移；它也可以在Th1细胞抵抗感染和肿瘤时提供帮助以及可以阻止部分细胞的分化，控制自身免疫病的发生和发展［9］。NKT细胞的活化主要依靠类脂多肽类抗原如半乳糖神经酰胺（alpha-galactosylceramide,简称α-galcer）和类似于MHC I类抗原的CD1d递呈抗原。目前还无法证明其他脂类或糖脂类抗原能否激活NKT细胞，并使其发挥功能。笔者以往的研究发现葡萄球菌肠毒素B（SEB）作为耐受原不仅能诱导淋巴细胞的耐受［4］ ，在异基因骨髓移植、皮肤移植和角膜移植中都显示出明显抗排斥效应［10、11］ ，而所有耐受特征和抗排斥作用都伴随NKT细胞的增加。尽管在角膜移植中使用SEB能使角膜移植片成功存活25天以上［5］ ，但是因为角膜是赦免部位（immune privileged site），它们通常与免疫系统隔离，角膜移植中由于角膜缺乏血管和淋巴管，淋巴细胞不易进入角膜，因此不易发生排斥反应，是成功率最高的器官移植。如果眼屏障被打破，淋巴细胞就可以进入眼内，排斥反应将加剧。为了研究SEB在高危角膜移植中的抗排斥效应和耐受形成中NKT细胞的重要作用，本文使用了角膜移植前用缝线法处理成血管增生的高危状态的大鼠，在遗传背景不同的大鼠间进行角膜移植的前后给受体鼠腹腔注射了25μg、50μg、75μg 和100μg /kg SEB并检查了SEB诱导的抗排斥作用和耐受形成的细胞学特征。这些结果显示，在角膜移植中使用适量的SEB（ 50ug、75μg/kg）可以使移植片的存活时间延长到10.70天到12.5天，比移植对照组长3～5天（P≤0.05，表1）。用这些获得了抗排斥能力的受体鼠的淋巴细胞与ConA或同种异体大鼠的淋巴细胞反应，其应答反应能力下降，A值分别由1.51下降到0.64和从0.83下降到0.47（表2）；与对照组相比，迟发型过敏反应（DTH）能力降低了约8倍（表3）。DTH反应性降低通常与角膜移植片长期存活和眼前房免疫偏位（anterior chamber-associated immuned deviation, ACAID）有关；ACAID是显示动物外周免疫系统耐受的指标，它破坏Th1细胞的应答反应，介导向Th2细胞偏移［12］。另外，在具有抗排斥能力的受体鼠中，随移植片存活时间的延长，CD4+T、CD8+T细胞数量减少， CD4+CD16+NKT细胞数量在脾脏和下颌腺中明显增加（表4，P≤0.05）,显示出SEB诱导的抗排斥作用与NKT细胞的大量存在有关。为了证明SEB活化的NKT细胞参与了SEB诱导的抗排斥作用，在角膜移植时同时使用地塞米松和SEB。表5的结果证明单独使用SEB可以使移植片存活时间延长并伴随CD4+CD16+NKT细胞的大幅增加；但地塞米松和SEB同时使用后，移植片不能存活，CD4+CD16+NKT细胞数量也明显低于正常值（表5）。这个结果表明能够活化NKT细胞的抗原除了α-galcer，SEB同样能够活化NKT细胞；活化了的NKT细胞具有生物功能，它们参与了机体的耐受性调节并在角膜移植中起到了抗排斥作用。SEB活化的NKT细胞是CD4+NKT细胞而不是CD4-NKT细胞［13，14］，因为它们分泌大量的IL-10 （表6）并很有可能介导了细胞向Th2细胞偏移。
本研究证明了SEB在高危角膜移植中诱导的抗排斥作用与NKT细胞的参与有关；并且证明了能够活化NKT细胞的抗原不限于α-galcer，SEB同样诱导出大量的CD4+CD16+NKT细胞。这些NKT细胞直接参与了SEB诱导抗排斥作用和耐受性调节，并有可能参与了促进了T细胞朝Th2细胞分化的过程。
【参考文献】
1 Taniguchi M. A novel lymphocyte—NKT. JSI Newsletter, 2000,8(1):15-16.
2 Seino KI, Fukao K, Muramoto K, et al. Requirement fot natural killer T(NKT) cells in the induction of allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98:2577.
3 Smyth MJ, Godfrey DI. NKT cell and tumor immunity-a double-edged sword. Nat Immunol, 2000,1:459.
4 陈钰，彭虹，尉承泽，等.超抗原SEB在同种异体细胞移植小鼠中诱导的免疫耐受极其特征.细胞与分子免疫学杂志，2002，18（2）：101-103.
5 Zhiqiang Pan, Yu Chen, Wenhua Zhang, et al. Rat corneal allograft survival proloned by the superantigen staphylococcal enterotoxin B. Invest Ophtbalmol Vis Sci， 2003,44:3346.
6 Williams KA, Coster DJ. Penetrating corneal tranplantation in the inbred rat: a new model. Invest Ophthalmol Vis. Sci， 1985,26:23-30.
7 Macdonald HR. NK1.1+T cell receptor-α/β+cells: New clues to their origin, spicifity,and function. J Exp Med， 1995,182:633.
8 Luc Van Laer. Regulation of immune responses by CD1d-restricted nature killer T cells. Immunologic Research， 2004,30(2):139-153.
9 Lucis B, Veronique L, Jan N, et al. NKT cells inhibit the onset of diabetes by impairing the development of pathogenic T cells specific for pancreatic βcells.
Immunity,2002,17:725-736.
10 接英，潘志强，陈钰，等.SEB诱导的免疫耐受治疗大鼠高危角膜移植的实验研究.中华眼科杂志，2005， 41(2):150-155.
11 陈钰，潘志强，彭虹，等.在小鼠异基因骨髓细胞移植中超抗原SEB诱导的耐受特征.细胞与分子免疫学杂志，2005， 21（5）：544-547.
12 Nakamura T, Terajewicz A, Stein-Streilein J. Mechanisms of Peripheral Tolerance following Intracameral Inoculation Are Independent of IL-13 or STAT6. J Immunol，2005，Aug15;175(4):2643-2646.
13 Sonoda KH, Stein-streilein J. Ocular immune privilege and CD1d-reative natural killer T cells. Cornea, 2002,21(2):33-38.
14 中村隆彦，园田康平,石桥达朗，等.ACAID诱导には通常のCD4阳性NKT细胞でなくCD4阳性NKT胞が必须である.Proceedings of the Japanese Society for Immunology(JSI), 2004，34:135.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30271385）
作者单位： 100853 北京，解放军总医院免疫学教研室
100730 北京，首都医科大学附属北京同仁医院，北京同仁医院眼科中心，北京眼科研究所
(编辑：余 强)