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H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测方法的初步建立

来源:中华医学实践杂志
摘要:【摘要】目的研制H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测试剂盒。方法将所获病毒通过鸡胚扩增,离心,纯化,通过测定最佳抗原工作浓度、最佳酶工作浓度、最佳血清工作浓度来确定ELISA检测方法。结果确定最佳抗原包被浓度为1:20000、酶工作浓度为1:10000、阳性血清最佳工作浓度1:1000。结论初步研制成功了H5N1亚型禽流感病......

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  【摘要】  目的  研制H5N1亚型流感病毒ELISA检测试剂盒。方法  将所获病毒通过鸡胚扩增,离心,纯化,通过测定最佳抗原工作浓度、最佳酶工作浓度、最佳血清工作浓度来确定ELISA检测方法。结果  确定最佳抗原包被浓度为1:20000、酶工作浓度为 1:10000、阳性血清最佳工作浓度1:1000。结论  初步研制成功了H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测试剂盒。

    【关键词】  禽流感病毒H5N1型;   抗体;   间接酶联免疫吸附试验

    The establishment of the putative indirect ELISA assay for avian influenza virus (AIV) H5N1 subtype

    LIU Xiang-mei,MIN Fan-gui,ZHAO Wei-bo,et al.Guangdong Laboratory Animal Monitoring Institute,Guangzhou 5100260,China

    【Abstract】  Objective  The aim of this study was to establish the method of ELISA for determination of antibody of avian influenza. Methods  Antigen was made by inoculating chick embryo. The optimal concentration of antigen、enzyme and the reference serum was decided in this study. The specific,and sensitive tests could be employed in this study.Results  The optimal concentration of antigen、enzyme and the reference serum was  1:20000、1:10000 and 1:1000.The sensitivity and specificity was very well in this method.Conclusion  It was successful to establish the method of ELISA for determination of antibody of avian influenza in this study.

    【Key words】  H5N1 avian influenza;   antibody;  enzyme-linked  immunosordent assay

    禽流感是禽流行性感冒(Avian Influenza)的简称,又称真性鸡瘟(fowl.plague),它是由正粘病毒科、流感病毒属、A型禽流感病毒(AIV)引起的禽类烈性传染病,被国际兽医局(OIE)定为A类传染病[1]。该病不仅给全世界的养禽业带来巨大的经济损失。也发生多次感染人的病例,特别是在2003年末又一次侵袭东南亚国家,造成大批人死亡。成为继SARS之后又一个严重威胁人类的病毒。我国是一个养禽大国,同时也是一人口密集的国家,因此对于严格控制禽流感的发生、准确诊断该病毒的研究具有重要的意义[2]。禽流感病毒抗体传统的诊断方法是ELISA、HI、AGP,但后两种方法敏感性较低。ELISA检测方法操作简便、具有灵敏度高、实际可操作性强等优点,目前国内中国农业科学院哈尔滨兽医研究所建立了检测禽流感的rNP-ELISA与全病毒间接ELISA(AIV-ELISA)诊断技术。国外已报道有检测禽流感抗体的试剂盒,但目前国内还没有AIV检测相关试剂盒的报道[3]。应用时购买渠道较窄。因此,我们在进行H5N1亚型禽流感感染小鼠模型研究之际,以H5N1型禽流感病毒为抗原,研制了特异的禽流感ELISA检测试剂盒。现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  毒株  (1)禽流感病毒H5N1型(由华南农业大学惠赠并经中国农科院哈尔滨兽医研究所鉴定)。(2)SPF鸡胚:9~12日龄鸡胚。(3)辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP,购自北京中山公司。底物为OPD。

    1.2  抗原的制备  根据参考文献[4]特异性抗原的制备:稀释病毒HA效价至23,0.2ml/只接种鸡胚尿囊腔。置于37℃,相对湿度为45%~60%的温箱内孵育。取24h以上死亡或48h以上没有死亡的鸡胚置4℃冰箱过夜,然后收集尿囊液。将收集的尿囊液以4000转/min低速离心5min,取上清液,测定禽流感病毒HA效价为:29。使用前70℃10min灭活病毒[3]。非特异性抗原的制备:收集经检测未感染有AIV的SPF级鸡胚尿囊液,4000转/min低速离心5min,取上清液作为非特异性抗原。

    1.3  对照血清的制备

    1.3.1  阳性血清对照  根据参考文献[5]的方法,抗原灭活后,接种SPF级ICR小鼠,制备高免血清。具体方法:

  第一次免疫:每只小鼠取100μg抗原与等体积完全福氏佐剂充分乳化后,腹腔免疫。

  第二次免疫:2周后,每只小鼠取100μg抗原与等体积不完全福氏佐剂充分乳化后,腹腔注射,加强免疫。

  第三次免疫:2周后,每只小鼠取200μg抗原腹腔注射再次加强免疫。

  1周后眼球采血,2000r/min离心5min,收集经HI试验检测禽流感病毒抗体为阳性的小鼠血清。最终HI效价为:8log2。-20℃保存作为阳性血清对照备用。

    1.3.2  阴性血清对照  眼球采血SPF级ICR小鼠。2000r/min离心5min,收集经HI试验检测禽流感病毒抗体为阴性的小鼠血清。-20℃保存作为阴性血清对照备用。

    1.4   ELISA工作流程以及相关的试剂配制  按照国标GB/T14926.50-2001中的方法进行配制和操作。

    1.5  方法的建立  根据参考文献[1,6,7],抗原最佳工作浓度的确定:将辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP 1:4000稀释,将抗原分别做以下稀释1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000、1:14000、1:16000、1:18000、1:20000、1:22000、1:24000、1:26000。将阴性、阳性血清1:40(按照国标);酶结合物最佳工作浓度的确定:辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP,分别做以下稀释1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000 ;将阴性、阳性血清最佳工作浓度的确定:稀释1:100、1:200、1:400、1:600、1:800、1:1000、1:1200;底物OPD在温箱内37℃避光显色10~15min。2mol/L H2SO4终止底物显色反应。在波长为490nm下测定其OD值。

      结果判定:固定其中一个条件不变,阳性血清与非特异性抗原反应OD值小于0.1,阴性血清与特异性抗原反应小于0.1,阳性血清与特异性抗原反应在1.0左右时,并且目测结果与OD值一致的最高稀释浓度为最佳工作浓度。

    1.6  特异性试验  选MHV、LCMV、Sendai 3种病毒抗体作为对照,与AIV阳性血清同时进行ELISA检测实验。以检测该试剂盒的特异性。

    1.7  敏感性试验  把阳性血清自200倍开始做连续稀释,按照ELISA工作流程进行试验,以看其P/N值。

    1.8  中间试验  按照已确定的最佳工作条件对选择的30份血清进行了检测。

    2  结果

    2.1  抗原最佳工作浓度的确定  由表1可以看出,本底值与抗原稀释度的大小无明显关系,但阳性值随着特异性抗原浓度稀释度的降低,OD值逐渐降低。当稀释达到1:20000时,阳性值为1.011,1:20000继续稀释浓度后OD值迅速下降。偏离标准OD值。同时P/N值也迅速下降。由于本底值很低,且受抗原包被浓度影响很小,同时阴性值也较低。因此确定抗原最佳工作浓度为1:20000的稀释度。表1  抗原最佳工作浓度的确定 注:A:阳性血清与特异性抗原反应OD值;B:阳性血清与非特异性抗原反应OD值;C:阴性血清与特异性抗原反应OD值;D:阴性血清与非特异性抗原反应OD值

    2.2  酶结合物最佳工作浓度的确定  抗原最佳工作浓度确定后,将辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP作为二抗,从表2中可以看出在酶浓度为1:10000时,OD值为1.126,并且在浓度稀释至1:10000以后,OD值迅速下降。因此,酶结合物最佳工作浓度确定为1:10000。 表2  酶结合物最佳工作浓度的确定

    2.3  阳性血清最佳工作浓度的确定  结果如表3。可以看出,阳性血清在1:1000时,OD值为1.112。并且在1:1000稀释以后的浓度,OD值迅速下降。而阴性血清不同稀释浓度对OD值影响很小。因此,阳性血清最佳工作浓度确定为1:1000。表3  阴性、阳性血清最佳工作浓度的确定

    2.4  特异性试验  选MHV、LCMV、Sendai阳性血清作为对照,与AIV阳性血清同时进行试验。结果如表4。可以看出该ELISA检测方法特异性较强。表4  特异性试验结果

    2.5  敏感性试验  由表5中可以看出,当血清稀释到1:10000时,所测OD值为0.317,P/N为3.202,仍可以判为阳性。从而证明本试验建立的方法,具有很好的敏感性。表5  敏感性试验结果注:A:阳性血清与特异性抗原反应OD值;B:阳性血清与非特异性抗原反应OD值;C:阴性血清与特异性抗原反应OD值;D:阴性血清与非特异性抗原反应OD值

    2.6  中间试验  应用本次实验建立的方法对实验样品30份血清进行了检测,其中HI试验所得的阳性样品应用本次所建立的方法进行复核,吻合率100%。本次试验结果如表6所示,可以看出本次试验建立的方法具有较好的敏感性。表6  中间试验结果

    3  讨论

    (1)ELISA方法是当今血清学检测中较为敏感而特异的检测手段之一。ELISA检测方法,在检测过程中简便、省时、省力。在结果判断过程中,比HI、AGP等方法更准确、客观,敏感性更高。本方法适合于基层临床禽类AIV感染状况,以及免疫后AIV抗体分泌情况的测定。同时,也为SPF鸡质量检测工作提供了有效的检测手段。

    (2)如何提高本试剂盒的敏感性和减少非特异性反应。首先是包被抗原以及浓度的选择,在本实验条件下,抗原选择SPF鸡胚尿囊液作为病毒扩增载体和非特异性对照,最佳工作浓度为1:20000,辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP作为二抗,最佳工作浓度为1:10000。阳性血清最佳工作浓度为1:1000。

    (3)应用该工作条件选择MHV、LCMV、Sendai 3种病毒作为样本进行了检测,并与阳性AIV相比较。结果MHV、LCMV、Sendai 3种病毒都为阴性,AIV为阳性。表明该方法具有良好的特异性。最后,应用该方法对所选的30份血清样品进行了检测,并与HI试验检测结果进行了比较,结果ELISA阳性检出率为:58.33%,而HI阳性检出率为:41%。表明该方法具有良好的敏感性。

    目前国外试剂盒价格昂贵、并且购买途径较窄,本所H5N1亚型抗体检测ELISA方法的建立将解决基层应用中的这一难题,同时也更加方便于临床检验及科学实验方面的研究。

    【参考文献】

    1  殷震,刘景华.动物病毒学,第2版.北京:科学出版社,1997.

    2  齐琳.禽流感及其防治.畜牧兽医科技,2004,5:22-23.

    3  禽流感实验室检测技术方案.基因快讯2004,2:26-27.

    4  中国医学科学院流行病防治所.常见病毒实验技术.北京:科学技术出版社,1978,34-37.

    5  金伯泉.细胞和分子免疫学实验技术.西安:第四军医大学出版社,2002,86.

    6  中华人民共和国国家标准GB 14922.2-2001.实验动物.微生物等级及监测.

    7  李昌文,刘怀然,关云涛,等.应用间接ELISA方法检测兔轮状病毒抗体的初步研究.中国比较医学杂志,2003,6:373-376.

   
    *基金项目:广东省农业攻关项目(编号:2004B20201028)

    作者单位:510260 广东广州,广东省实验动物监测所(Δ通讯作者)

    (编辑:罗  彬)

作者: 刘香梅,闵凡贵,赵维波,刘忠华 2006-8-20
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