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【摘要】 目的 血液中肿瘤细胞释放的DNA长链有望成为肿瘤检测的标志物，与正常组织细胞凋亡释放较短和均匀一致DNA片段相比，肿瘤坏死导致释放异常的DNA片断。方法 为了验证血液中长链DNA是肿瘤相关标志物，用实时PCR方法检测了45例肺癌患者和45例非肿瘤患者血液中长链DNA的浓度及其指数。结果 发现平均长链DNA指数在肺癌组明显高于对照组非肿瘤患者（P＜0.01），在ROC曲线上，假设长链DNA对肺癌特异性是100%，长链DNA指数的临界点是0.59，长链DNA诊断肺癌最高敏感性是 67%（95%可信区间=0.54～0.74），55.6%Ⅰ期肺癌患者长链DNA指数在这个临界点以上，72.2%Ⅱ期以上肺癌患者长链DNA指数在这个临界点以上。结论 研究提示血浆长链DNA与癌症有一定关联，血浆长链DNA的检测可能提供了一个简单和不太昂贵的癌症检测方法。
【关键词】 肺癌；标志物；长链DNA
The study of the detection of plasma DNA integrity for lung comcer patient
XIA Ming-cheng,MA Jia-yong,LI Hou-huai,et al.
Department of Respiratory,Affiliated Jiangbei People’s Hospital,the Medical College of the Dongnan University Nanjing 210048,China
【Abstract】 Objective Tumor-released DNA in blood represents a promising biomarker for cancer diagnosis. It has been supposed that tumor necrosis causes release of DNA of varying sizes, which contrasts apoptosis in normal tissue that releases smaller and more uniform DNA fragments.Methods To test the hypothesis that increased DNA integrity,ie,a longer DNA strand is a tumor-associated marker in plasma DNA.We determined the genomic DNA integrity index in plasma DNA, using real-time PCR assay. A DNA integrity index and DNA concentration in plasma were determined in 45 patients with lung cancer and 45 patients without neoplastic disease. Results We found the median DNA integrity index in the neoplastic group was significantly higher than that in the noneoplastic group(P＜0.0001),under the receiver-operating characteristic curve，given 100% specificity, the highest sensitivity achieved in detecting the cancer group was 67%(95%confidence interval=0.541～0.74)at the index cutoff of 0.59，55.6%percents stage Ⅰ cancers had a DNA integrity index above this cutoff.72.2% stage Ⅱ and above stage Ⅱ cancers had a DNA integrity index above this cutoff. Conclusion Our findings suggest that increased DNA integrity in plasma is associated with cancer, and measurement of DNA integrity may provide a simple and inexpensive measure for cancer detection.
【Key words】 lung cancer； marker； long chain DNA
血液中肿瘤细胞释放的长链DNA有望成为癌症诊断的标志物，我们知道实体恶性肿瘤通过细胞坏死和凋亡释放大量的基因片段DNA进入血液循环［1］。
肿瘤释放的DNA作为特定基因的改变的结果能被检测到，包括微卫星改变、等位基因失衡、移位、突变和病毒癌基因的存在［2］, 尽管这些基因的改变的结果已经提示可作为临床应用，然而在肿瘤检测实际应用时却有许多技术上的难关，因此渴望得到一个简单而又经济的方法用于癌症早期诊断和人群普查。
为了达到这个目标，笔者用实时PCR方法根据下面的假设来检测血浆中长链DNA，在实体肿瘤，肿瘤坏死是一种很常见的现象，它产生了一定范围具有不同长度的DNA片段，由于自由的和不完全的基因DNA消化，产生了长链DNA片断。而细胞死亡在正常组织主要是通过凋亡而产生较短和均匀一致长度在185～200bp以内的DNA片段［3］,为了验证这种假设，笔者在总共90例肿瘤和非肿瘤患者的血浆样本进行对照研究，通过实时PCR方法检验血浆中长链DNA的存在。
1 材料与方法
1.1 样本和基因DNA的分离
1.1.1 血浆样本 来源于45例经病理确诊的肺癌患者和45例非肿瘤的呼吸系统良性病变的患者，两组年龄差异无显著性，肺癌组（50.5岁），对照组（50.1岁），患者资料见表1。
1.1.2 实验过程 5～10ml血浆（用EDTA抗凝）以2000r/min的速度离心10min，从血浆顶部小心吸取500nl，DNA提取用200nl血浆，用罗氏公司DNA提取试剂盒，DNA也存在于肺癌细胞株中，其可作为对照，DNA定量试剂盒（用罗氏公司核酸探针）被用来测定人工指导下的DNA浓度。
1.2 DNA链完整性分析
1.2.1 DNA链测定 用Lightcycle PCR扩增仪，采用半定量实时监测测定其完整性，β-actinJj基因几乎存在于所有正常人和肿瘤细胞中，其PCR产物在400bp处和100bp处的比率被定义为半定量比率。
表1 患者的资料(略)
1.2.2 实验过程 2μl DNA加10μl PCR缓冲液的混合液加3mmol/L MgＣl2加2mmol/L dNTP加0.07u/μl Taq聚合酶，复制用引物由上海京都生物科技公司提供，100bp和400bp片段用相同的上游引物：5-GCA-A-3，100bp的下游引物是5-GT-C-3, 400bp的下游引物是5-TG-CCC-3，PCR扩增条件:95℃变性3min，95℃ 30s,57℃ （100bp）或56℃ （400bp）30s，72℃ 10s（100bp）或15s（400bp）共45个循环， Lightcycle软件在每个循环监测SYb2Green1荧光,从肺癌细胞培养基中提取的DNA可作为测定血浆中DNA链完整性的参考,因为培养的细胞中含有完整的DNA,每个反应的ct值由Lightcycle软件包处理，肺癌细胞株对照中的ct值减去400bp处ct值得到400bp处Δct值，肺癌细胞株对照中的ct值减去100bp处的ct值得到100bp处的Δct值, 100bp处的Δct值减去400bp处Δct值得到ΔΔct值，完整性的分析是用指数（-ΔΔct×ln 2）计算的，所有样本都是盲段的，即事先不知道样本的资料。
1.3 血清CYFRA21-1的检测方法 晨起抽空腹静脉血5ml，分离血清，-20℃保存待用，有专人负责按操作规程进行检测工作。血清CYFRA21-1采用放射免疫学方法，试剂盒购自法国CIS公司，推荐阳性诊断标准为CYFRA21-1＞3.6ng/ml。
1.4 统计学分析 t检验用来比较肿瘤和非肿瘤病人DNA的完整性分析，ROC曲线被用来评估应用血浆DNA链的完整性和DNA浓度作为检测肺癌和其他癌症诊断工具的可行性，ROC曲线是敏感性对特异性的一个曲线［4］, 用来评估试验的可行性，即ct值的不同。CYFRA 21-1 检测结果以x±s表示，组间均数比较采用t检验。
2 结果
2.1 在所有样本长链DNA指数分布 见图1。在肺癌患者和对照组非肿瘤患者长链DNA指数分布范围很大，在肺癌组长链DNA指数均数为0.67（可信范围0.43～0.91），其明显高于对照组长链DNA指数均数0.15。
图1 血浆长链DNA指数的散点图(略)
2.2 10例有代表性的样本的PCR结果的凝胶电泳图 显示在图2。肺癌患者血浆样本可见到100bp和400bp的PCR结果的凝胶电泳强度相似的条带；在对照组患者血浆样本100bpPCR结果的凝胶电泳条带显示很清晰，而400bpPCR结果的凝胶电泳条带显示不明显，表示肺癌患者较多的血浆长链DNA片段，而对照组血浆长链DNA片段相对很少。
图2 10例样本的PCR结果的凝胶电泳图(略)
2.3 ROC曲线分析用于评价长链DNA的检测对于诊断恶性肿瘤疾病的价值 以各指标敏感性为纵坐标，1-特异性为横坐标，长链DNA指数的ROC曲线见图3，取长链DNA指数0.59为临界点，长链DNA对肺癌诊断的特异性是100%，诊断肺癌的敏感性是67%。
图3 血浆长链DNA检测肺癌的ROC曲线(略)
2.4 当取长链DNA指数0.59为诊断肺癌的临界点 Ⅰ期肺癌患者9例，5例患者长链DNA指数＞0.59，阳性55.6%;Ⅱ期以上肺癌患者36例,26例患者长链DNA指数＞0.59，阳性72.2%。
2.5 血浆长链DNA在两个独立检测人员检测同样样本的结果相关性较好 相关系数r=0.957,见图4。
图4 两个独立检测人员检测同样样本的结果相关性图(略)
2.6 血清CYFRA21-1 在本研究中肺癌患者和对照组检测结果，经组间均数t检验差异有显著性(P＜0.01) ，见表2。血清CYFRA21-1和血浆长链DNA在肺癌诊断的特异性和敏感性见表3。
表2 肺癌患者和对照组患者CYFRA21-1检测结果(略)
表3 血清CYFRA21-1和血浆长链DNA在肺癌诊断中的特异性和敏感性(略)
3 讨论
肺癌已成为当今世界各地最常见的恶性肿瘤，半个世纪以来，其发病率和死亡率不断上升。据资料，2002年美国新增病例17.7万，有16万人死于该病［5］, 按照目前的诊断和治疗方法，肺癌的5年生存率不超过15%，其主要原因在于缺乏有效的早期诊断方法及对转移性肺癌有效的治疗。随着肿瘤分子生物学研究的进展，已经用于临床较成熟的肺癌血清标志物有CEA、NSE、CYFRA21-1、SCC、TPA等，在肺癌的早期诊断、治疗反应、病变发展及转移复发等预后判断的监测方面均显示其临床应用的价值，但因其有限的敏感性和特异性，往往不能满足临床的需要，因此寻找高度灵敏、高度特异的肿瘤标志物仍然是人们关注的问题,而异常遗传分子标志物如原癌基因Kras突变、抑癌基因P53、微卫星改变、启动子甲基化、端粒酶等大多数标志物目前还处于实验研究阶段，在这些标志物应用临床之前，还需要大量的对照实验和诊断性能的评价。目前，循环DNA的定量及定性研究备受人们关注，大量研究结果显示循环DNA与相应的原发肿瘤细胞在遗传特性变异上相一致，即循环DNA仍能维持及表达肿瘤细胞来源的分子遗传特性。近年来的研究表明肿瘤患者血浆DNA含量明显高于良性疾病， 并发现转移性肿瘤患者可显示更高浓度的血浆DNA 。一些实验研究观察到肺癌患者中循环DNA含量的高低与疾病进展相关，即血浆DNA含量增高的癌症患者的生存率明显下降，由此提示血浆DNA含量分析在肺癌的诊断和预后判断中具有十分重要的意义。由于血清和血浆具有取材方便、无创性并可连续检测的优点，血清或血浆DNA的研究有着非常良好的前景。
本研究依据正常组织细胞死亡通过凋亡释放较短和均匀一致的长度在185～300bp以内的DNA片段，肿瘤坏死导致释放异常的DNA片段，它产生了一定范围具有不同长度的DNA片断，通个实时PCR方法检测血浆中长链DNA的存在，因此血液中肿瘤细胞释放的长链 DNA有望成为肿瘤检测的标志物。
目前使用的肺癌相关的标志物，单一检测敏感性、特异性欠佳，诊断的准确性不高，所以采用联合检测，建立较理想的组合模式很重要［6］。CYFRA21-1是细胞角质蛋白19片段（cytokeratin19,CK19），角蛋白19是一种酸性多肽，它主要分布于单层上皮细胞，如支气管上皮细胞等，当细胞癌变可有CK19片段释放，肺癌中CYFRA21-1含量尤为丰富，肺癌CYFRA21-1水平分析已被多项研究证明对诊断肺癌有临床价值［7］，腺癌、鳞癌均有CK19表达，而小细胞肺癌主要表达CK18，有时可表达CK19，所以CYFRA21-1尤其适用于非小细胞肺癌，是一种对非小细胞肺癌灵敏，特异度高的肺癌标志物。本文CYFRA21-1单独检测肺癌的特异性91.7%,敏感性65.4%,与长链DNA联合检测特异性97.1%,敏感性94.3%，因此，CYFRA21-1与长链DNA联合检测可以提高肺癌诊断的特异性和敏感性。
本研究提供了充足证据肺癌患者的血浆长链DNA的检测对于肺癌的诊断具有很高的特异性和较高的敏感性，血浆长链DNA可作为肺癌诊断的标志物，与其他目前正在研究的相关基因标志物相比，这种检测方法可能提供了一种简单和不太昂贵的癌症诊断方法，这种方法甚至可用于普通人群的癌症的普查。尽管还需要进一步研究证实在其他肿瘤病人同样可检测到长链DNA，理论上长链DNA对肿瘤是广谱的、非肺癌所特有的，国外有关长链DNA在妇科恶性肿瘤病人检测的结果与本文相似［8］，在长链DNA应用于临床之前，还需要进一步对长链DNA诊断的性能进行评价。在本研究中血浆长链DNA对肺癌诊断的特异性是100%时敏感性是67%，也许敏感性还可以提高，通过对不同染色体的100bp和400bpPCR扩增结果进行分析，在癌症患者100bp的染色体被删除,对400bp的染色体进行扩增,当长链DNA指数定义在400bp相对100bp富裕的染色体条带,癌症患者的长链DNA指数也许会提高,这样长链DNA对癌症诊断的敏感性会提高,更说明它的有效性。长链DNA的检测结果同样可以和目前明确的有较高敏感性的血清肿瘤标志物的结果联合分析，可以提高它们对癌症诊断的特异性和敏感性,目前单一血清标志物对癌症诊断的特异性不高［9］。在今后的研究中可以选择更有代表性的对照组,包括不同的年龄组和不同的疾病,对长链DNA诊断癌症的性能进行评价。
【参考文献】
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3 Boynton KA,Smmerhayes IC,Ahlqist DA,et al.DNA integrity as a potential marker for stool-based detection of colorectal cancer.Clin Chem in Press,2003.
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7 陈书盘.评价酶联免疫检测血清CYFRA21-1对非小细胞肺癌的诊断价值.肿瘤，1997，17（5）：258-261.
8 Brant G，Wang,Han-Yao Huang,et al. Increaed plasma DNA Integrity ientin cancer patients. Cancer Research，2003, 63(15)，3996-3968.
9 Zhang Z.Combining multiple biomarkers in clinical diagnostics:a review of methods and issues.Ed.1.Washington DC:AACC Press,2002.
(编辑：罗 彬)
作者单位：210048 江苏南京，东南大学医学院附属南京江北人民医院呼吸科(Δ胸外科，ΔΔ检验科)
215006 江苏苏州，苏州大学第一附属医院呼吸科