复方隔山消颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠p53及PCNA蛋白表达的影响

    复方隔山消颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠p53及PCNA蛋白表达的影响 (pdf)

    【摘要】  目的  观察复方隔山消颗粒对实验性慢性萎缩性胃炎大鼠p53基因及增生细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法  采用热盐水灌胃方法制作慢性萎缩性胃炎动物模型，以不同剂量的复方隔山消颗粒进行治疗后，用免疫组化法检测大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白的表达。结果  经过热盐水灌胃造模后，大鼠胃黏膜腺体萎缩。以复方隔山消颗粒治疗后，大鼠胃黏膜腺体萎缩明显减轻，胃黏膜细胞p53阳性表达率和PCNA标记指数显著降低。结论  复方隔山消颗粒治疗慢性萎缩性胃炎的机制可能是通过抑制突变型p53基因及PCNA蛋白的表达，从而恢复细胞增殖与凋亡的平衡来实现的。

    【关键词】  复方隔山消颗粒；慢性萎缩性胃炎；p53；PCNA

      Effects of compound geshanxiao granules on p53 and PCNA expression in chronic atrophic gastritis of rats

    HE Ming-bin，QU Ya-li，LI Wen-sheng，et al.Sanitation Bureau of Yiling District in Yichang City，Yichang 443100，China

    【Abstract】  Objective  To observe the effects of Compound Geshanxiao Granules on p53 gene and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in experimental chronic atrophic gastritis of rats. Methods  With hot Saline instillation method to produce rat experimental chronic atrophic gastritis model，after treatment with Compound Geshanxiao Granules，detecting the expression of rat gastric mucous membrane p53 and PCNA with immunohistochemistry method. Results  After the instillation of hot Saline the gland of rat gastric mucous membrane was atrophic. After the treatment of Compound Geshanxiao Granules atrophy decrease clearly，the rate of p53 positive expression and PCNA labeling index in gastric mucous membrane cell decrease significantly. Conclusion  The mechanisms of the therapy of Compound Geshanxiao Granules on chronic atrophic gastritis may involve inhibiting the expression of mutant p53 gene and PCNA protein.

    【Key words】  compound geshanxiao granules；chronic atrophic gastritis；p53；proliferating cell nuclear antigen

    慢性萎缩性胃炎（CAG）是消化系统疾病治疗中的难点之一，属于癌前病变，对人类健康威胁较大。复方隔山消颗粒由隔山消、枳实、黄连、党参、三七等11味中药组成，具有养阴益气、健脾导滞、祛瘀生新之功效，临床用于治疗CAG取得了较好疗效，并发现其作用机制可能与其促进血中胃泌素和胃动素分泌有关［1］。本实验进一步观察了复方隔山消颗粒对CAG大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白表达的影响，现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  SD大鼠，体重200±20g，雄性，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

    1.2  药物与试剂  复方隔山消颗粒由本院制剂室制备，临用时用蒸馏水配制成合适浓度的混悬液；抗p53单克隆抗体(DO-1)，由北京中山生物技术有限公司提供；PCNA单克隆抗体和LSAB试剂盒，由DAKO公司(日本)生产。

    1.3  模型制作及给药方法  取健康SD大鼠110只，随机分为5组，每组22只，即正常对照组、模型对照组和隔山消高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余各组均采用热盐水灌胃方法制作CAG动物模型［2］。即用55℃的15%氯化钠溶液灌胃，每日1次，每次2.5ml，共12w。实验开始，先处死5只正常对照组大鼠，并留取胃大体标本作为对照，以后各组每2w处死2只大鼠，取胃标本进行病理检查，以观察胃黏膜萎缩情况，判断造模是否成功。从第13w开始灌服药物治疗，至第24w末结束。其中隔山消高、中、低剂量组分别予复方隔山消颗粒相当于原生药5g/（kg.d）、2.5g/（kg.d）和1.25g/（kg.d）灌胃，正常对照组和模型对照组予等量蒸馏水灌胃。

    1.4  检测指标及方法  各组实验结束将大鼠断头处死后剖腹取全胃，沿大弯剖开，生理盐水漂洗摊平作大体观察，沿胃小弯条状取材。胃黏膜标本经10%甲醛液固定，石蜡包埋切片。免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(S-P)，按试剂盒内说明书操作。阳性对照为已知阳性组织切片在同一条件下反应，阴性对照以正常兔血清代替第一抗体。结果判断标准参考文献［3］。p53结果按如下方法进行评分：(1)阳性着色程度：无着色为0，浅着色为1，深着色为2；(2)阳性着色范围：无着色为0，着色小于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫性着色为3。然后将以上两项评分相加，结果大于或等于3者为阳性病例。PCNA结果用PCNA标记指数（LI）表示：LI=PCNA阳性细胞数/计数细胞总数×100%。在高倍镜下选取5个有代表性的视野，每个视野记数100个细胞，计算PCNA阳性细胞表达率。

    1.5  统计学处理  采用t检验和χ2检验，SAS统计软件计算机处理。

    2  实验结果

　　p53阳性着色位于细胞核，呈棕黄色颗粒状(图1)，各切片显色分布不均，以片状和局灶性为主，少数为弥漫性分布。PCNA阳性着色位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状(图2)。CAG模型大鼠在给予复方隔山消颗粒治疗后，p53阳性表达率和PCNA LI明显降低。其中隔山消高、中剂量组p53阳性表达率明显低于模型对照组（P<0.05），隔山消各剂量组PCNA LI显著低于模型对照组(P<0.01或P<0.05)。见表1。表1  各组大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白的表达比较注：与模型对照组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01

    3  讨论

　　正常胃黏膜细胞的增生与凋亡维持着细胞总数的平衡，这种平衡的失调在CAG到胃癌的发展过程中起重要作用。细胞凋亡受众多基因调控，其中p53基因是与人类肿瘤发生相关性最高的突变基因，位于17号染色体短臂上，对细胞的生长有重要的调节作用。野生型p53基因在细胞损伤修复过程中，监视着基因组DNA的完整性。当细胞受到射线或某些药物作用而发生DNA损伤时，p53基因所编码的蛋白能使细胞分裂停止在G1期，待细胞充分修复DNA的损伤后，再进入细胞周期。倘若损伤不能修复，野生型p53基因就启动细胞的凋亡过程而引导细胞的程序性死亡，阻止具有癌变倾向的突变细胞出现。但野生型p53基因很容易发生突变，转变成突变型p53基因。当p53基因发生突变时就会丧失其调节功能，导致p53介导的细胞周期调节失控，DNA分子程序紊乱，发生遗传不稳定性及多倍体，导致细胞恶性增生［4］。野生型p53基因表达的蛋白半衰期甚短，一般检测方法难以检出，而当基因发生突变时，其表达的蛋白质构型发生改变，半衰期延长，因此免疫组化测得的p53蛋白为突变型蛋白［5］。正常胃黏膜细胞中无突变型p53表达，但在慢性萎缩性胃炎向肠上皮化生过程中，及在异型增生阶段内其阳性表达率增至60%［6］。PCNA又称周期素，是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白，其合成与表达反映了细胞的增殖状态。细胞动力学研究表明，PCNA的表达及合成与细胞增生周期有关，G1期PCNA逐渐增多，S期达高峰，因此它能准确地反映细胞的生长速度和状态［7］。PCNA阳性细胞的多少与肿瘤发展、预后均有密切关系。在CAG的肠化和不典型增生阶段，随着细胞增生活跃程度的加重，其PCNA阳性表达率明显增高［8］。笔者对热盐水致CAG模型大鼠和正常大鼠胃黏膜细胞p53及PCNA蛋白的表达进行免疫组化测定，发现前者p53阳性表达率和PCNA LI显著高于后者。说明CAG模型大鼠细胞增殖活性明显升高，易于向恶性转化。给予复方隔山消颗粒治疗后，大鼠胃黏膜细胞p53阳性表达率和PCNA LI显著降低。提示复方隔山消颗粒治疗CAG的分子生物学机制可能是通过抑制突变型p53基因及PCNA蛋白的表达，从而恢复细胞增殖与凋亡的平衡来实现的。

    (本文图片见封三)

    【参考文献】

    1  黄祖明，李文胜，屈克义，等. 复方隔山消颗粒对实验性慢性萎缩性胃炎大鼠胃泌素和胃动素的影响. 中华医药杂志，2006，6（5）：507-508.

    2  张沥. 热盐水致大鼠萎缩性胃炎动物模型建立. 世界华人消化杂志，2002，（20）：581-583.

    3  伍银桥，王孟薇，吴本俨，等.胃癌变前后凋亡相关蛋白和PCNA的表达.世界华人消化杂志，2004，12(4)：770-773.

    4  Kaelin WG. The emerging p53 gene family. National Cancer Inst，1999，91：594.

    5  Brambilla E，Gazzeri S，Moro D，et al. Immunohistochemical study of p53 in human lung carcinomas. Am J Pathol，1993，143：199-210.

    6  Shiao YH，Rugge M，Correa P，et al. p53 alteration in gastric precancerous lesions. Am J Pathol，1994，144： 511.

    7  Landberg G，Tan EM，Roos G. Flow cytometric multiparameter analysis of proliferating cell nuclear antigen cyclin and Ki-67antigen. Exp Cell Res，1990，187：111.

    8  王仰坤，纪小龙，马乃绪，等．萎缩性胃炎中p53和PCNA的表达．新消化病学杂志，1997，5(4)：237-238.

   作者单位： 1 443100 湖北宜昌，宜昌市夷陵区卫生局

    2 443100 湖北宜昌，宜昌市夷陵医院

    3 430030 湖北武汉，华中科技大学同济医学院

　　(编辑：罗  彬)