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Home医源资料库在线期刊中华医学实践杂志2006年第5卷第11期

VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参治疗机制的研究

来源:中华医学实践杂志
摘要:VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参治疗机制的研究(pdf)【摘要】目的探讨VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参活血化瘀改善胎儿血供的可能机制。方法采集妊娠肝内胆汁淤积症患者血清,Jaffe法分离培养脐静脉内皮细胞,用ICP患者血清刺激培养的内皮细胞,模拟ICP的体内环境,行丹参干预,与正常妊娠血清......

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  VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参治疗机制的研究 (pdf) 

    【摘要】  目的  探讨VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用以及丹参活血化瘀改善胎儿血供的可能机制。方法  采集妊娠肝内胆汁淤积症患者血清,Jaffe法分离培养脐静脉内皮细胞,用ICP患者血清刺激培养的内皮细胞,模拟ICP的体内环境,行丹参干预,与正常妊娠血清组比较,不同含量作用不同的时间,MTT法检测细胞活力,ELISA法检测分泌型VEGF蛋白表达。结果  ICP患者血清与HUVECs共培养:(1)MTT法发现随着血清含量的增加A值逐渐降低(0~20%),且低于相应浓度的正常妊娠血清组,有统计学差异;(2)ELISA法发现:同正常孕妇血清组相比,ICP患者血清组HUVECs表达分泌型VEGF蛋白降低,且随着血清含量的增加和培养时间的延长,VEGF表达逐渐降低。不同浓度的丹参干预后随着含量的增加(1~8mg/ml),细胞活力和VEGF蛋白表达逐渐升高,以8mg/ml组作用最佳。结论  ICP患者血清对HUVECs具有损伤作用,使细胞活力降低。其损伤作用可能与VEGF的分泌减少有关。丹参对内皮细胞具有保护作用并能增加 VEGF蛋白的表达。丹参可能通过增加VEGF蛋白的表达具有活血化瘀作用,改善胎盘和胎儿的血供而改善围生儿预后。

  【关键词】  妊娠肝内胆汁淤积症;脐静脉;血管内皮细胞;血管内皮生长因子;丹参
  
  Study of the effects of vascular endothelial growth factor and the therapeutic mechanisms of Salvia Miltiorrhiza Bge in intrahepatic cholestasis of pregnancy

  DU Xue-han,GAO Jun,JIA Rui-zhe.

  Department of Obstetrics & Gynecology, NO.1 People’s Hospital of Xuzhou, Xuzhou 221002,China

  【Abstract】   Objective  To sudy the effects of vascular endothelial growth factor and the therapeutic mechanisms of Salvia Miltiorrhiza Bge in intrahepatic cholestasis of pregnancy(ICP). Methods  Twelve patients with ICP and twelve normal pregnancy women take part in this study,their serum is collected before therapy when in hospital. Endothelial cells are isolated from human umbilical veins choosed among the 10 normal pregnancy  according to Jaffe’s method, serum of different concentration of ICP groups and normal pregnancy groups is cocultured with HUVECs for different time point respectively. MTT method is applied to measuring the vitality of HUVECs.The expression value of vascular endothelial growth factor(VEGF) is detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Results   Compared with normal pregnancy , the value of MTT in ICP serum groups,the A value is significantly lower,P<0.05. The value of soluble VEGF in ICP serum group is lower than that in the nomal pregnancy serum group.With the serum concetration increases, the value of sVEGF decreases in the ICP groups . Compared with ICP group, the value of MTT and sVEGF in the Salvia Miltiorrhiza Bge therapeutic group increases with the concentration increase,8mg/ml of Salvia Miltiorrhiza Bge is the optical concentration. Conclusion  Serum of ICP patients impairs HUVECs in vitro and decreases the expression of VEGF. The mechanism of serum of ICP patients impairs HUVECs maybe by decreasing the expression of VEGF. Salvia Miltiorrhiza Bge could protect HUVECs against the injury of ICP serum and promotes the expression of VEGF. Salvia Miltiorrhiza Bge improves HUVECs by increasing the value of VEGF.

  【Key words】  intrahepatic cholestasis of pregnancy; umbilical vein; vascular endothelial cell(VEC);vascular endothelial growth factor; Salvia Miltiorrhiza Bge

  妊娠肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是一种妊娠特异性的疾病[1],以孕妇出现全身或局部皮肤瘙痒、黄疸及胆酸增高为特征。ICP可引起严重的围生儿并发症,围生儿发病率和死亡率明显增加。关于ICP胎儿宫内缺氧的机制尚不清楚。胎盘-胎儿血供受到一系列生长因子的调节,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种直接而特异作用于血管内皮细胞的高效促有丝分裂因子,在刺激新血管发生与生长及维持血管壁的完整性和通透性方面均有重要意义。VEGF对于受精、着床、胎盘血管形成及胎儿生长发育起着重要的作用。表达异常则可能导致胎儿宫内氧供不良,对围生儿产生不良影响。具有行气活血作用的中药—丹参,临床上被用于治疗ICP以改善围生儿预后。本文以ICP患者血清与正常脐静脉内皮细胞共培养并用不同含量的丹参注射液进行干预,探讨VEGF在妊娠肝内胆汁淤积症中的作用,以及丹参活血化瘀改善胎儿血供的可能机制。

  1  资料与方法

  1.1  研究对象  收集2003年8~12月在东南大学附属中大医院和南京市妇幼保健院妇产科住院的正常妊娠和ICP患者各12例,无菌抽取孕妇肘前静脉血。选取择期剖宫产的足月妊娠脐带10例。纳入标准:正常妊娠组:整个孕期无合并症或并发症;ICP组:ICP诊断标准遵照《中华妇产科学》[2],并排除合并妊高征,糖尿病、肾病、原发性高血压贫血及其他内科合并症。孕龄诊断正确,否认有吸烟、激素治疗史。剖宫产指征:均未临产,系因骨盆、胎位、珍贵儿及社会因素等而行择期剖宫产者。

  1.2  方法  参照Jaffe法行脐静脉内皮细胞原代培养,经倒置相差显微镜、Giemsa 染色和人第Ⅷ因子抗原鉴定为血管内皮细胞。以正常妊娠孕妇血清作为对照,当细胞融合60%-80%时,加入不同浓度的ICP患者血清刺激24h, MTT法检测脐静脉内皮细胞的活力;不同含量的ICP患者血清分别刺激12h、24h、36h,按照ELISA试剂盒操作步骤检测培养上清液中分泌型可溶性VEGF的变化。不同含量的丹参注射液进行干预,分别检测细胞活力和VEGF蛋白的变化。

  1.3  试剂和仪器  RPMI Medium 1640培养基:GIBCO BRL公司产品;胎牛血清(100ml/瓶):杭州四季青生产;Ⅳ型胶原酶:H&Y biochemical corporation 公司产品;MTT粉剂,购自SIGMA公司;ELISA试剂盒购自晶美生物工程北京有限公司。GBB16型CO2培养箱,OLYMPUS CK2型倒置显微镜,SPECTRA MAX250型酶联免疫检测仪,96孔培养板。

  1.4  统计学分析  数据均以x±s表示,组间多个样本均数间比较采用方差分析,两两之间用q检验,两样本均数比较用成组t检验。(采用SPSS 11.5统计软件)

  2  结果

  2.1  ICP患者血清对脐静脉内皮细胞活力的影响  ICP患者血清刺激内皮细胞24h后,细胞吸光度(A)值随着浓度的增加逐渐降低;并低于相应浓度的正常血清组(P<0.05)。具体数据如表1所示。

  表1  不同浓度的正常孕妇和ICP患者血清干预后HUVECs的A值(略)

  2.2  ICP患者血清对脐静脉内皮细胞分泌VEGF蛋白的影响  不同浓度的 ICP患者血清刺激不同的时间,HUVECs分泌VEGF蛋白量具体数据见表2。ICP患者血清各浓度组均低于相应浓度正常组,有统计学差异。随着血清含量的增加,VEGF蛋白量降低,有统计学差异。此外随着ICP患者血清与HUVECs作用时间的延长,VEGF蛋白的分泌量逐渐降低。

  表2  不同浓度的ICP患者血清干预后HUVECs分泌VEGF蛋白量(略)

  注:10%ICP患者血清组,24h、36h和12h相比 △P<0.05;20%ICP患者血清组,24h、36h和12h相比△△P<0.05

  2.3  丹参注射液对脐静脉内皮细胞活力的影响  在20%ICP患者血清干预的同时,分别加入不同含量丹参注射液共同培养24h后,相应组别的细胞吸光度(A)值见表3。与ICP患者血清组相比,随着丹参含量的增加,其A值逐渐增加。

  表3  不同浓度的丹参注射液干预后HUVECs的A值(略)

  注:与ICP组比1)P<0.05

  2.4  丹参注射液对脐静脉内皮细胞分泌型VEGF蛋白的影响  20%ICP患者血清和不同含量的丹参注射液共刺激HUVECs 24h后,ELISA法检测培养上清液中VEGF蛋白量的变化,具体数据见表4。

  表4  不同浓度的丹参注射液干预24h后HUVECs分泌的VEGF量(略)

  注:与ICP组比1)P<0.05

  3  讨论

  妊娠肝内胆汁淤积症是一种妊娠特有的疾病,其对孕妇的损伤相对较轻,妊娠终止后1~2天患者的瘙痒症状消失,胆汁酸、转氨酶等也迅速恢复正常。但其对围生儿的影响严重,围生儿的发病率和死亡率明显升高,如导致早产、胎儿宫内窘迫、死胎、死产等,成为高危妊娠极为棘手的疾病[1~3]。

  ICP胎儿宫内缺氧、围生儿预后不良的确切机制尚不明了。胎儿在母体内血、氧的供应来自于胎盘,胎盘血管的发育受到血管内皮生长因子等一系列生长因子的调节。研究发现[4]妊娠全过程中胎盘、胎儿均有较高的VEGF及其受体的表达,并具有时间和空间的特异性。Winther[5]提出VEGF对胎盘的形成和发育起重要作用,其在胎盘中表达量的变化与胎盘血管的发育相一致。妊娠早期VEGF促进胎盘血管网络的发育,妊娠晚期又发挥调节血管完整性和通透性的作用,维持母胎之间的营养交换。Stephen[6]等发现羊的胎儿胎盘动脉内皮细胞中通过自分泌机制调节胎盘的血管发生和其他功能。

  ICP的母体循环、胎儿循环、羊水及胎粪均表现为高胆汁酸水平,研究发现胆汁酸对细胞具有毒性作用,并与浓度和时间呈正相关。有学者在体外应用胆汁酸刺激培养的血管内皮细胞,结果发现细胞膜的通透性增强,细胞凋亡。在胆汁酸等病理因素的刺激下,胎盘绒毛滋养细胞及胎盘血管内皮细胞受损,导致VEGF的分泌量降低,因此血管发生、增加血管通透性、调节内皮细胞的完整性等功能降低,这一结果更加重了滋养细胞和内皮细胞的受损,导致胎儿缺氧等严重的并发症。本实验以ICP患者血清与脐静脉内皮细胞共培养发现,与正常妊娠组相比,ICP患者血清刺激后的内皮细胞活力降低,细胞增殖缓慢,随着血清浓度的增加细胞的活力逐渐降低,表现为MTT实验的A值降低。说明ICP患者血清对内皮细胞具有损伤作用。通过ELISA检测培养上清液中的VEGF蛋白含量发现,随着血清浓度的增加VEGF蛋白量降低,相同浓度下,VEGF分泌量随血清培养时间的增加而降低。在ICP患者血清的干预下,可使内皮细胞自分泌血管内皮生长因子降低,VEGF具有促内皮细胞的有丝分裂作用,因此细胞数目减少,细胞活力降低。由此推论,ICP时内皮细胞分泌VEGF的降低,导致了胎盘、胎儿血管生发和血管通透性的降低,导致了胎儿供血、供氧的不足,进而出现一系列的并发症。

  中医理论认为ICP湿热内蕴,营卫不和,气滞血行不畅[7]。丹参已被临床用于治疗ICP减轻患者的瘙痒症状。大量研究表明丹参对血管内皮细胞具有保护作用[8,9],能够减少细胞的氧化损伤、抑制细胞的凋亡。本实验以ICP患者血清和HUVECs共培养,并用不同含量的丹参注射液进行干预。MTT结果表明:丹参干预后细胞的A值增加,随着药物浓度的增加(1~8mg/ml)A值逐渐升高,具有一定的浓度依赖性。这表明丹参能促进脐静脉内皮细胞的生长、增殖,对血管内皮细胞具有保护作用,能抑制或减轻ICP患者血清对脐静脉内皮细胞的损伤。在一定浓度的范围内,此种保护作用随着浓度的增加而增加。中医学认为“气血相关”、“补气活血”,因此具有行气活血作用的丹参药可能具有促血管生成作用。丹参活血化瘀、对内皮细胞的保护作用是否与VEGF有关?仅徐杰等[10]研究发现丹参多酚酸盐能使单核细胞VEGFmRNA分泌升高,并能促进内皮细胞的迁移。本实验也证实了丹参注射液能使受损伤HUVECs的分泌VEGF蛋白增加(ELISA法检测培养液中的VEGF),随着浓度的增加,VEGF分泌量具有一定的浓度依赖性。丹参促使VEGF蛋白分泌增加与对血管内皮细胞地保护作用相一致。由此推论丹参可能通过促使脐静脉内皮细胞自分泌VEGF这一内皮细胞的有丝分裂原,促进内皮细胞的分裂、增殖,加速细胞的生长,进而间接的保护了内皮细胞;内皮细胞增殖的加速以及功能的维持又促进了VEGF的表达和分泌。因此,丹参可能通过增强内皮细胞的VEGF表达,促使血管生发和增强血管的通透性,胎盘部位血流灌注增加,促进了母胎之间血、氧交换,改善了围生儿因血供不足而引起的缺氧窘迫、发育迟缓,从而改善了围生儿预后。

  【参考文献】

  1  Germain AM,Carvajal JA,Glasinovic JC, et al. Intrahepatic cholestasis of pregnancy:an intriguing pregnancy-specific disorder. J Soc Gynecol Investig, 2002,9:10-14.

  2  曹泽毅.中华妇产科学.北京:人民卫生出版社,1999,500-507.

  3  Reyes H. Review: intrahepatic cholestasis. A puzzling disorder of pregnancy. Gastroenterol Hepatol,1997,12:211.

  4  Cheung CY, Brace RA. Developmental expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in ovine placenta and fetal membranes.Soc Gynecol Invest, 1999,6:179-185.

  5  Winther H,Dantzer V.Co-localization of vascular endothelial growth factor and its two receptors flt-1 and kdr in the mink placenta.Placenta,2001,22(5):457-465.

  6  Tsoi SC, Wen Y, Chung JY,et al.Co-expression of vascular endothelial growth factor and neuropilin-1 in ovine feto-placental artery endothelial cells. Molecular and Cellular Endocrinology,2002,196:95-106.

  7  刘淑余.胆郁合剂治疗妊娠肝内胆汁淤积症.上海中医药杂志,1990,31(7):9.

  8  冯愉态,陈再智.丹参治疗心血管疾病作用研究进展.医学信息,2001,14(11):778.

  9  刘振国,乌云塔那.丹参注射液的药效学研究进展。中国民族民间医药杂志,2002,54:6.

  10  徐杰,范维琥.丹参多酚酸盐对人血管内皮细胞迁移的影响.中西医结合学报,2003,1(3):211.

  (编辑:石  岚)

  作者单位:221002 江苏徐州,徐州市第一人民医院妇产科

       510000 广东广州,中山大学医学院

       210002 江苏南京,南京市妇幼保健院

作者: 杜雪寒,高军,贾瑞喆
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