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【摘要】 目的 检测临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的情况，了解产超广谱β-内酰胺酶临床分离菌的耐药特性，并探讨耐药性产生的基因背景。方法 通过对近两年（2004～2005）北京地区医院收集到的共295株大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌，进行产ESBLs菌株表型鉴定、PCR检测基因型、等电聚焦电泳鉴定等电点，并对这些菌株耐药的特性和基因型进行了探讨。结果 ESBLs的检出率为18.6%，其中大肠埃希菌的检出率为27.7%，肺炎克雷伯杆菌的检出率为8.57%。引起耐药的基因型主要为TEM型81.8%（45/55），其次CTX-M型74.5%（41/55），然后是SHV型20%（11/55）。大肠埃希菌以TEM型为主（88.4%），肺炎克雷伯杆菌以CTX-M为主（91.7%）。经等电聚焦电泳验证，少数菌株的耐药由TEM、SHV、CTX型酶之外的ESBLs引起。结论 产ESBLs菌在临床上较为普遍，大肠埃希菌以TEM型为主，肺炎克雷伯菌以CTX-M型为主， CTX-M型酶对肺炎克雷伯杆菌的头孢噻肟耐药性起重要作用。
【关键词】 超广谱β-内酰胺酶；耐药性；基因型；等电点
Resistant phenotype and genotype of extended spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
YANG Xin-yi, XIANG Qian, LI Cong-ran,et al.Institute of Medicinal Biotechnology，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050, China
【Abstract】 Objective To compare the hydrolyzation for different kind of the strains or the genotype of the β-lactamase.Methods 295 strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from hospitals in Beijing were studied in our research. We detected their resistant phenotype, genotype and isoelectric point. Results 18.6% of strains of the family Enterobactericeae were considered ESBLs producers by double disk synergy test. The prevalences of ESBLs in isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were 27.7% and 8.57%, respectively. TEM type (81.8%,45/55) β-lactamase was the main type among those ESBL-producing strains, followed by CTX-M type(74.5%, 41/55) and SHV type (20%, 11/55). In the Escherichia coli, the incidence of TEM, CTX-M, SHV were 88.4%(38/43), 69.76% (30/43) and 4.65%(2/43). In the Klebsiella pneumoniae the incidence of CTX-M, 91.7%(11/12). From the results of isoelectric point, we found a few strains produce the β-lactamases which were not detected in the PCR. These β-lactamases is not include in the 5 type of ESBLs. Conclusion ESBL-producing strains are common among hospital strains of E. coli and K.pneumoniae. TEM type β-lactamase was the main type among those E. coli, and CTX-M was among K.pneumoniae. CTX-M type ESBLs were play an important role in the resistance.
【Key words】 extended-spectrum β-lactamases; drug resistance;genotype; isoelectric point;
大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌是医院感染常见的革兰阴性杆菌，第三代头孢菌素的广泛使用使细菌对这些药物产生了耐药，产生超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）是革兰阴性菌对第三代头孢菌素耐药的主要原因。自1983年首次报道发现第一个ESBLs TEM-3后，ESBLs的流行日益严重，世界各地均有报道，且数量和基因型不断增加。ESBLs通常为质粒介导，同一质粒可同时携带多个耐药基因，引起多重耐药。最常见的ESBLs由TEM-1、2和SHV-1突变而来，它们主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌产生，它们大部分是头孢他啶酶，少部分是头孢噻肟酶。其次还有头孢他啶酶PER、VEB、TLA-1、GES/IBC和头孢噻肟酶CTX-M（Toho）、SFO-1、BES-1等［1］。本研究以大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌作为主要的研究对象，以3个常见的基因型TEM型、SHV型和CTX-M型为检测对象，鉴定两种细菌产ESBLs的情况，产ESBLs菌株的耐药特性，同时在此基础上探讨耐药性与基因型的关系，对进一步认识超广谱β-内酰胺酶和临床合理使用抗生素有指导意义。
1 材料与方法
1.1 细菌 试验菌株为实验室保存典型菌种及近两年(2004～2005)从北京地区医院收集的295株临床分离菌，其中肺炎克雷伯杆菌140株，大肠埃希菌155株。
1.2 抗生素 头孢他啶(Ceftazidime, CAZ) 中国药品生物制品检定所，含量84.9%,批号0484-9901；头孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 中国药品生物制品检定所，批号130483-200303，含量89.3%；克拉维酸(Clavulanic acid, CVA) 浙江永宁制药厂，批号04214014,含量99.2%。药物配制时按实际活性药物计算。称好的药物采用0.85%氯化钠溶液制成溶液，试验时现配现用。
1.3 产ESBLs菌鉴定［2］ 参考NCCLS推荐标准，采用酶抑制剂增强的平皿琼脂二倍稀释法(MIC法)进行ESBLs产酶菌的筛选实验，质控菌选用大肠埃希菌ATCC 25922、ATCC 35218，肺炎克雷伯杆菌ATCC 700603。MH肉汤培养基和MH琼脂培养基均购自中国药品生物制品检定所。
1.4 DNA模板提取［3］ 划线接种于LB琼脂上，37℃恒温过夜。挑单个菌落接种于15ml LB肉汤中，37℃孵箱振荡培养18h。将菌液倒入15ml离心管中，离心,弃上清，用无菌蒸馏水洗菌体一次,弃上清，用1ml TE缓冲液（pH 7.6）悬浮菌体，并将液体转入1.5ml离心管中,将离心管置于96℃水浴，15min,12000×g，离心10min。将上清吸出，在另一干净离心管中混匀后分装。此上清为PCR中使用的DNA模板。
1.5 PCR 采用20μl反应体系扩增目的基因：DNA模板3μl，上游、下游引物各0.2μl，Taq酶0.3μl，10×Taq buffer和PCR染料各2μl，dNTPs 0.5μl，无菌双蒸水11.8μl。反应引物：TEM型上、下游引物分别为上游5’-ATAAAATTCTTGAAGACGAAA-3’和下游5’- GACAGTTACCAATGCTTAATCA-3’［4］； SHV型上、下游引物分别为上游5’-CTCGCCTTTATCGGCCCTCAC-3’和下游5’-CGGCCACGCGGGTTAGCG-3’［3］； CTX-M-1型上、下游引物分别为上游5’-CGCTTTGCGATGTGCAG-3’和下游5’-ACCGCGATATCGTTGGT-3’［3］； CTX-M-2型上、下游引物分别为上游5’-CCTTTCCGCCTTCTGCTC-3’和下游5’- ACGCTACCCCTGCTATTT-3’［5］； CTX-M-9型上、下游引物分别为5’-AACACGGATTGACCGTCTTG-3’和下游5’-TTACAGCCCTTCGGCGAT-3’［6］。 TEM-1、SHV-1和CTX-M-3为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照。
1.6 β-内酰胺酶粗提 划线接种于营养琼脂上，37℃过夜；挑单个菌落接种于5ml营养肉汤中，37℃恒过夜；从5ml营养肉汤中取0.5ml加到20ml营养肉汤中，37℃孵箱振荡培养4～6h，200转/min；将营养肉汤移入15ml离心管中，4℃，6700×g，15min；弃去上清，用 PBS（pH7.0）溶液洗2次，4℃，6700×g，15min；弃上清，加入0.5ml 0.01M PBS溶液，悬浮菌体；超声破碎（250W，30s/30s）,超声过程在0℃冰水浴中进行；离心，20000×g，1.5h，取上清。
1.7 等电聚焦电泳 根据美国BIO-RAD公司等电聚焦电泳槽Model 111 Mini说明书进行。TEM-1、TEM-3、TEM-15、TEM-88、TEM-89、SHV-1、SHV-18 和CTX-M-3为阳性对照［3,4,7,8］，对部分产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行电泳。
2 结果
2.1 产ESBLs菌检出率 295株临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌产ESBLs率为18.6%（55/295），其中大肠埃希菌27.7%（43/155），肺炎克雷伯杆菌8.57%（12/140）。
2.2 产ESBLs菌耐药性分析 见表1。表1 产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的MIC值分布 从表1中可见，大部分产ESBLs肺炎克雷伯杆菌对头孢噻肟耐药，占66.7%，但对头孢他啶耐药仅占33.3%。大部分产ESBLs大肠埃希菌对头孢噻肟和头孢他啶均耐药，分别占46.5%和58.1%。
2.3 β-内酰胺酶基因型 见表2。
2.4 等电点 见表3。
根据PCR结果，产TEM型酶占81.8%（45/55），产SHV型酶为20%（11/55），产CTX型为74.5%（41/55），其中13株同时产CTX-M-3类和CTX-M-9类。产两种基因型以上的细菌占70.9%（39/55）。实验中未检测到CTX-M-2型酶。
大肠埃希菌以产TEM型为主（88.4%），其次是CTX-M型（67.4%），SHV型的检出率很低（4.65%）；肺炎克雷伯杆菌以CTX-M为主（91.7%），其次是SHV型（75%）和TEM型（58.3%）。表2 大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌不同基因型分析表3 部分大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌的MIC值、基因型和等电点注：* TEM型酶pI=5.2～6.5，SHV型酶pI=7.0～8.2
根据TEM、SHV酶的等电点范围，将测定的各个等电点与基因型对应，例如：肺炎克雷伯杆菌5-43经PCR鉴定产SHV和CTX-M-1型2种β-内酰胺酶，经等电聚焦电泳得到2个条带，pI分别是7.6、8.6。7.6在SHV型酶的范围内认为是SHV酶的等电点，8.6是CTX-M-1型酶的等电点。
IEF结果表明，大肠埃希菌5-19（TEM，pI=5.6）、5-43（CTX-M-1，pI=8.2）只产一种β-内酰胺酶，4-29、4-89和5-35分别产3或4个β-内酰胺酶，其中一个是TEM型，其他几个是本实验PCR检测5类之外的β-内酰胺酶。肺炎克雷伯杆菌4-69（pI=7.4）只产一个CTX-M-1型酶。肺炎克雷伯杆菌5-19等电聚焦电泳只得到一个7.4的条带，而PCR鉴定SHV、CTX-M-1型均为阳性，这有两个可能：第一，此菌产的SHV、CTX-M-1型酶具有相同的等电点；第二，此菌SHV型酶的5次PCR中有一次为阴性，可能其他4次出现假阳性，该菌只产一个等电点为7.4的CTX-M-1型酶。
3 讨论
本组140株肺炎克雷伯菌和155株大肠埃希菌产ESBLs的发生率分别为8.57%和27.7%，高于国外相关报道［9］，但肺炎克雷伯菌检出率较国内其他地区低［10］。
MIC测定结果表明，大部分产ESBLs的肺炎克雷伯杆菌对头孢噻肟耐药（占66.7%），对头孢他啶敏感（耐药占33.3%），此差异与产CTX-M型酶有关：这些肺炎克雷伯杆菌中CTX-M型酶的检出率为91.7%（11/12），CTX-M型酶是头孢噻肟酶［11］，所以产ESBLs肺炎克雷伯杆菌降解头孢噻肟的能力比头孢他啶强，表现出高的MIC值。在对单个菌株的研究中，结合MIC、基因型和等电点发现：只产一个CTX-M型酶的菌株（大肠埃希菌 5-43、肺炎克雷伯杆菌 4-69）对头孢噻肟的MIC值均高于头孢他啶，不产CTX-M型酶的肺炎克雷伯杆菌5-21对头孢噻肟的MIC值为8，对头孢噻肟敏感。大肠埃希菌5-15同时产TEM、SHV、CTX-M-1型酶，对头孢他啶（MIC＞64）和头孢噻肟（MIC＞64）均耐药。经以上分析得知CTX-M型酶与肺炎克雷伯杆菌的头孢噻肟耐药性有直接关系。
本研究表明，在产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中TEM型酶是最常见的β-内酰胺酶，其次是CTX-M型，然后是SHV型。其中肺炎克雷伯菌以CTX-M型为主，大肠埃希菌以TEM为主，大肠埃希菌中SHV型的检出率很低4.65%。比较国内相关报道与该报道基本一致，但本研究中CTX-M型酶的检出比率明显较高。比较2006年最新的文献报道：大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的CTX-M检出率为78.4%［12］，这与本试验结果（74.5%）相近，说明国内CTX-M型的产出率近年有上升的趋势。
PCR结果发现本研究中大部分临床分离菌检出两种或两种以上的基因型（70.9%），说明多重耐药在临床分离菌中较普遍。结合等电点分型发现其中部分菌株产除TEM、SHV、CTX-M型之外的β-内酰胺酶，例如4-89、5-35。同时也证明得到一些只产一个ESBL的菌株如：大肠埃希菌5-19（TEM，pI=5.6）、5-43（CTX-M-3，pI=8.2），肺炎克雷伯杆菌中4-69（CTX-M-3，pI=7.4）、5-21（SHV，pI=7.5），由于这些菌株产酶单一，可用于克隆、抗生素水解等实验中，有利于研究酶的特性。
近年国内有关ESBLs的报道中，还未发现有产TEM型ESBLs的临床分离菌报道，本研究中对部分临床分离菌进行了等电点的测定也发现大部分TEM型酶的pI在5.4左右或5.6，而TEM-1 的pI=5.4 、TEM-2的pI=5.6，可能这些菌株产TEM-1或TEM-2。同时，有部分菌株TEM型的pI在6.0以上，可能为ESBLs或新型的广谱β-内酰胺酶，有待测序验证。
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作者单位：100050 北京，中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所（△通讯作者）