Literature
首页医源资料库在线期刊中华医学实践杂志2007年第6卷第8期

肺炎克雷伯杆菌产β-内酰胺酶耐药性质粒的提取及鉴定

来源:《中华医学实践杂志》
摘要:【摘要】目的探讨耐药性质粒在肺炎克雷伯杆菌中的耐药机制。方法采用琼脂稀释法测定临床分离的31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗生素的耐药性,采用质粒DNA小量制备的碱裂解法对耐药菌株进行质粒提取,通过转化试验对质粒的耐药性进行鉴定。结果31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素、氨苄西林......

点击显示 收起

【摘要】  目的 探讨耐药性质粒肺炎克雷伯杆菌中的耐药机制。方法 采用琼脂稀释法测定临床分离的31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素氨苄西林和头孢菌素类抗生素的耐药性,采用质粒DNA量制备的碱裂解法对耐药菌株进行质粒提取,通过转化试验对质粒的耐药性进行鉴定。结果 31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗生素有不同程度的耐药现象。其中从两株耐药性肺炎克雷伯菌中分离出两种质粒,经转化后鉴定为耐药性质粒,大小分别为2.3kb和8.2kb。结论 肺炎克雷伯杆菌的临床分离株的耐药性部分决定于耐药性质粒的存在。

【关键词】  肺炎克雷伯杆菌;质粒;耐药性检测

    Extraction and identification of resistance(R) plasmids mediated β-lactamase in  Klebsiella pneumoniae

    CHENG Fu-bo,ZHANG Xue-ying,SUN Yan-bo.Baiquen Medical College,Jilin University,Changchun 130021,China

    【Abstract】  Objective  To explore the mechanisms of resistance plasmid in Klebsiella pneumoniae. Methods  Antimicrobial susceptibility testing of Klebsiella pneumoniae isolates were performed using agar dilution, plasmid DNA were extracted by alkaline lysis, and R plasmid were identified by transformation. Results  31 strains of Klebsiella pneumoniae isolates exhibit resistance in some extent to cephalosporin, ampicillin and azithromycin. Two R plasmids, 2.3kb and 8.2kb, were isolated from two strains of  Klebsiella pneumoniae isolates. Conclusion  Drug resistance of Klebsiella pneumoniae isolates was determined by R plasmids. 

    【Key words】  klebsiella pneumoniae; plasmid; drug resistant test

    肺炎克雷伯杆菌是造成医院感染社区感染的重要致病菌。随着各种新型广谱β-内酰胺类抗生素的大量使用,细菌的耐药性也在逐年上升,并且出现了多重耐药现象。质粒介导的产β-内酰胺酶而导致细菌耐药是肺炎克雷伯杆菌耐药的重要原因之一[1]。同时质粒介导的耐药性可通过细菌间接合、转化和转导等形式进行耐药性的传播,从而造成耐药菌株的流行。肺炎克雷伯菌质粒介导的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因也已经被发现[2]。因此,质粒介导的耐药性的研究已经成为研究的热点。本研究对31株临床分离的肺炎克雷伯杆菌进行了耐药性检测,对耐药菌株进行了质粒的提取及鉴定。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌株来源   肺炎克雷伯杆菌来源于2005年11月~2006年6月吉林大学附属中日联谊医院和长春中医药大学附属医院分离并鉴定。受体菌:大肠杆菌JM109 由本实验室保存

    1.1.2  药品和试剂   氨苄西林(购自华北制药股份有限公司),头孢拉定头孢噻肟钠头孢哌酮钠头孢曲松钠(购自上海新先锋药业有限公司),阿奇霉素(购自杭州澳亚生物技术有限公司),超广谱β-内酰胺酶测定盒(购自杭州天和微生物试剂有限公司),酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)(购自BioFlux公司),普通营养琼脂培养基(购自杭州天和微生物试剂有限公司)。质粒提取液(按文献[2]配制)溶液Ⅰ:含50mmol/L的葡萄糖,25mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA;溶液Ⅱ:含0.2mol/L NaOH和1%SDS(现用现配);溶液Ⅲ:5mol/L KAc 60ml,HAc 11.5ml,水28.5ml 配制成100ml 的溶液。

    1.2  方法

    1.2.1  抗生素敏感试验  采用琼脂稀释法检测阿奇霉素、氨苄西林、头孢拉定、头孢噻肟头孢哌酮头孢曲松6种抗生素对31株肺炎克雷伯杆菌的MIC50 和MIC90。

    1.2.2  质粒DNA的抽提  采用碱裂解法[3]。挑取单菌落,接种于7ml LB液体培养基(含抗生素)中,37℃、225rpm震荡培养过夜(约12~14 h)。取1.5ml 培养物加入Eppendorf管中,4℃、12000×g 离心1min,弃上清,使细菌尽可能干燥。将细菌重悬于100μl 预冷的溶液Ⅰ中,剧烈震荡,使菌体分散。加200μl 新配制的溶液Ⅱ,上下颠倒5次混匀(不要震荡),置冰上2min。加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,温和的混匀10s,置冰上5min。4℃、12000×g 离心7 min,小心移出上清于另一Eppendorf管中。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇,震荡混匀1min,4℃、12000×g 离心5 min,小心移出上清于另一Eppendorf管中。重复上一步骤再抽提1次。加入1/10体积的3mol/L NaAc混匀,再加入2倍体积的无水乙醇,-20℃沉淀30min。4℃、12000×g 离心15 min,去上清,室温干燥。70%乙醇洗涤沉淀1次,室温干燥5min。沉淀溶于15μl TE(含RNAse 20μg/ml)中,震荡混匀,-20℃保存备用。

    1.2.3  感受态细胞的制备(氯化钙法)[3]  从37℃过夜培养的大肠杆菌平板中挑取单一菌落,转至2ml LB液体培养基中,37℃、225rpm震荡培养过夜。取培养物1:40稀释到含新鲜LB液体培养基的锥形瓶中,37℃、225rpm继续震荡培养至吸光度值为0.5左右(约3 h)。菌液冰浴10min,4℃、6000×g 离心10min,弃上清。加1/2初始培养物体积预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细菌,冰浴10min。4℃、6000×g 离心5min,弃上清。加1/25初始培养物体积预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬浮细菌,4℃保存备用。

    1.2.4  质粒的转化[3]  取200μl 感受态细菌于1.5ml Eppendorf管中加入3μl DMSO(二甲亚砜)混匀,加入10μl 质粒DNA,混匀,置冰上30min。42℃水浴90s,迅速转移到冰上30min。加满LB液体培养基,37℃、225rpm继续震荡培养45min,使细菌复苏。4℃、6000×g 离心2 min,弃上清,加入100μl 新鲜LB液体培养基重悬菌体。将混合液涂在预热的含有抗生素(100μg/ml)的LB固体培养板上,37℃过夜培养。观察细菌的生长状况,并挑取单个菌落接种培养。

    1.2.5  琼脂糖凝胶电泳  取15μl提取的质粒溶液用0.8%琼脂糖(含0.5μg/ml 溴乙锭)100V 电泳50 min,于紫外透射分析仪上观察结果并照相

    2  结果

    2.1  药敏试验结果  31株临床分离的肺炎克雷伯杆菌对各种抗生素的耐药结果见表1。表1  31株肺炎克雷伯杆菌的MIC50、MIC90值从表1 中得知,31株肺炎克雷伯杆菌对氨苄西林的耐药率最高为90.3%,对阿奇霉素、头孢拉定、头孢噻肟、头孢哌酮和头孢曲松的耐药率分别为19.4%、71.0%、32.3%、64.5%和38.7%。

    2.2  质粒DNA提取结果  用碱裂解法从一株耐氨苄西林的肺炎克雷伯菌中提取出一分子量为2.3kb大小的质粒,此外,还从另一株耐氨苄西林和头孢拉定的耐药肺炎克雷伯杆菌中提取出一分子量为8.2kb大小的质粒。电泳结果见图1。

   3  讨论

    自1941年β-内酰胺类抗生素—青霉素首次应用于临床以来,现已有多种类型的抗生素投入使用,但同时细菌对抗生素的耐药性也相继被发现,细菌耐药已经成为全球关注的问题。目前研究发现,质粒介导的耐药为肠杆菌科细菌耐药的主要原因之一[4],质粒介导的水解β-内酰胺类抗生素的酶主要为Bush分类Ⅱ型AmpC β-内酰胺酶和Ⅱbe型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。有文献报道,质粒编码的ESBLs其基因型包括TEM、SHV及CTX-M [2]。

    本研究检测到肺炎克雷杆菌的耐药性较强,对阿奇霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗生素有不同程度的耐药,其中对氨苄西林的耐药性最强,高达90.3%,对阿奇霉素、头孢拉定、头孢噻肟、头孢哌酮和头孢曲松的耐药率分别为19.4%、71.0%、32.3%、64.5%和38.7%。    本研究采用碱裂解法提取质粒,该方法为简单、适用于细菌质粒DNA提取的方法,为大多数实验室广泛使用。从两株肺炎克雷伯菌中提取到了两种质粒,大小分别为2.3kb和8.2kb,经转化鉴定,确定两种质粒都对氨苄西林耐药,其中8.2kb质粒还表现出对第一代头孢菌素类抗生素头孢拉定耐药,而对第三代头孢菌素均敏感,说明肺炎克雷伯杆菌的耐药性可以由质粒决定,另外,分子量较大的质粒还决定了肺炎克雷伯杆菌的多重耐药。实验过程中还发现存在2.3kb质粒的耐药肺炎克雷伯菌同时对头孢拉定耐药,而质粒的转化子却仅表现为对氨苄青霉素耐药,由此可推断其对头孢拉定的耐药为染色体所介导。肺炎克雷伯杆菌属于肠杆菌科细菌的成员,而肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗生素耐药是世界范围内耐药性监测网所关注的重要领域之一[5,6],因此,监测肺炎克雷伯杆菌耐药性、了解其耐药机制,为指导临床医生合理利用抗生素提供重要的依据。

【参考文献】
  1 王琴, 杨萍, 胡静仪, 等. 60株肺炎克雷伯菌多重耐药性及主要耐药基因的研究. 天津医药, 2005, 33(6): 338-341.

2 Xiong ZZ, Zhu DM, Wang F,et al. A Klebsiella pneumoniae producing three kinds of class Aβ-lactamases encoded by one single plasmid isolated from a patient in Huashan Hospital, Shanghai. China Antimicrobial Agents,2004,23: 262-267.

3 J 萨姆布鲁克, EF弗里奇, T曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南,第2版.北京:科学出版社, 1992,10.

4 Nordmann P. Trends in beta-lactam resistance among Enterobacteriaceae. Clin Infect Dis, 1998, Suppl 1: 100-106.

5 朱德妹, 汪复, 张婴元. 2003年上海地区细菌耐药性监测. 中国抗感染化疗杂志, 2005, 5 (1): 4-12.

6 马越, 金少鸿. 我国细菌耐药性监测研究的新特点. 中华检验医学杂志, 2005, 28 (4): 344-348.


作者单位:1 130021 吉林长春,吉林大学白求恩医学院(七年制) 2 吉林长春,吉林大学中日联谊医院检验科 3 吉林长春, 吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室(Δ通讯作者)

作者: 成伏波, 张学英, 孙延波 2008-6-30
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具