慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白的表达

【摘要】  　　目的 探讨慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白的表达， 以探讨老年抑郁症的发病机制。 方法 将20只Wistar老年大鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组大鼠每天强迫游泳20min,并每周给予电刺激和强光照射各1次，经过21天应激制作老年大鼠慢性应激抑郁模型，对照组正常喂养，不给予上述处理。采用特异性抗体标记的免疫组织化学方法，检测实验21天后老年大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白的表达情况，并观察大鼠开场行为和排便情况。结果 实验组老年大鼠中央格停留时间延长，水平穿越格数减少，修饰行为减少，排便次数增多，c-fos平均灰度值：实验组166.56±9.73 vs对照组149.62±12.91（P=0.000）,阳性细胞数：实验组41.12±4.72 vs对照组31.12±3.25（P=0.000）， caspase-3平均灰度值：实验组202.59±2.64 vs对照组179.74±8.24（P=0.000）,阳性细胞数：实验组24.73±2.57 vs对照组18.86±1.13（P=0.000）。结论 慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白表达增加，行为表现异常， 可能与慢性应激所致细胞凋亡增强、海马区脑组织损伤有关。

【关键词】  慢性应激；抑郁；c-fos蛋白；caspase-3；行为

　　Expression of c-fos and caspase-3 protein in geriatric rats hippocampus CA3 area induced by chronic stress

    ZHANG Hong-wei, HOU An-ji,HU Yan,et al. Department of Geriatrics and Oncology,  Shanghai No 7 People’s  Hospital, Shanghai 200137, China

    【Abstract】  Objective  To observe the expression of c-fos and caspase-3 protein in geriatric rats hippocampus CA3 area induced by chronic unpredictable mild stress in order to understand the nosogenesis of depression. Methods  20 geratic Wistar rats were randomizedly divided into experimental group and control group, 10 rats for each. In experimental group, rats were forced to swim 20 minutes each day plus electricity stimulation  once a week, in control group, no special intervention were added. After 21 days , the expression of c-fos and caspase-3 protein were detected by immunohistochemistry marked by special antibodies, meanwhile, the open-field behavior and defecation condition before and after experiment were observed. Results  In experimental group, geriatric rats showed prolonged immobility time, ambulation and modification time decreased, feces increased; c-fos mean gray scale: 202.59±2.64 vs 179.74±8.24（P=0.000）, positive cell number: 41.12±4.72 vs 31.12±3.25（P=0.000）; caspase-3 mean gray scale: 202.59±2.64 vs 179.74±8.24（P=0.000）, positive cell number:24.73±2.57 vs 18.86±1.13（P=0.000）. Conclusion  The expression of c-fos and caspase 3 protein increased in hippocampus CA3 area of geriatric rats induced by chronic unpredictable mild stress, behavior showed abnormal, which might be related to the augment of cell apoptosis and the brain damage in hippocampus induced by chronic stress.

    【Key words】  chronic stress; depression; c-fos protein; caspase-3; behavior

    随着我国逐步步入老龄化社会，老年人抑郁症发病率有逐年升高的趋势，并引发系列社会问题［1］，一般认为抑郁症为功能性精神障碍，但利用CT、MRI等影像技术手段，发现抑郁症并非完全功能性疾病，抑郁症患者海马区存在与慢性应激大鼠相似的形态改变，如海马神经元丧失、海马体积减小等变化［2］。神经元缺失一般有凋亡和坏死两种机制，究竟是哪种机制起作用抑或是两种机制共同作用目前还不清楚。

    c-fos是一种原癌基因，当机体受损害性刺激时即表达c-fos蛋白，但在慢性抑郁症时c-fos蛋白表达是否异常尚无定论。近年来的研究发现，caspase家族是大多数细胞凋亡发生的共同途径，实验提示，caspase的抑制可阻断β淀粉多肽（Aβ）诱导的神经元凋亡，提示caspase家族在抑郁发病中可能起重要作用［3］。Katz等［4］利用大鼠连续3周处于应激状态制作慢性应激所致抑郁动物模型，具有较高的应用价值，该研究采用慢性应激模型，观察老年大鼠海马区c-fos 和caspase家族代表性成员caspase-3蛋白的表达，以了解二者的变化情况，进一步揭示老年抑郁症的发病机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  老年Wistar大鼠，雄性，12月龄以上，体重350±50g, SPF级，共20只，由武汉大学实验动物中心提供。试验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2003－2004，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2003－2013，动物实验－SPF级，繁殖供应－SPF级。

    1.2  动物分组  将老年大鼠置于昼夜节律光照条件下，自由进食饮水，室温控制在18℃～20℃，饲养7天以使动物适应环境，1周后进行开场行为测定（open-field）并称重，行为评定由课题组两位成员同时进行，盲法评定，然后取平均值，根据计算器产生一组随机数，依随机数将大鼠分为实验组和对照组，每组10只，实验组动物每笼1只，对照组每笼5只，实验开始前评价两组动物开场行为和体重，各指标间差异无显著性（P>0.05），见表1。表1  大鼠开场行为分析及体重测定结果注：各组间实验前后比较，*P<0.05,**P<0.01; 实验组与对照组实验后比较，△△P<0.01

    1.3  老年大鼠慢性应激抑郁模型的制作  每天强迫大鼠游泳，将大鼠置于一800mm×500mm×400mm的整理箱中，水温保持15～20℃，每次游泳20min, 共21天，其间每周并给予电击足底刺激（1mA,45V,每次刺激10s，间隔1min, 共10次）、夹尾1 min 1次， 禁食48h 1次, 对照组则不给予上述处理，自由进食饮水。

    1.4  主要设备  HPIAS-2000 型彩色图像分析仪(同济千屏影像工程公司软件)，Leica RM2145轮转式切片机。

    1.5  主要试剂  兔抗大鼠c-fos多克隆抗体（美国Santa Cruz公司提供）；兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体（武汉博士德公司提供）；SP 试剂盒（美国ZYMED公司产品，北京中山生物技术有限公司分装）。

    1.6  动物处理  于实验结束后1天，再次进行开场行为测定并称重，然后用戊巴比妥快速麻醉动物，开胸，经左心室快速灌注37℃生理盐水约200ml, 再灌注中性甲醛200～300ml，断头，取脑组织修块，置于10%中性福尔马林溶液中固定。

    1.7  常规石蜡切片(厚4～5μm)HE 染色  染色结果：普通光镜下可见，细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。

    1.8  免疫组化染色［5］  切片脱蜡入水，蒸馏水洗2次×3min；用0.01M pH 6.0柠檬酸缓冲液抗原修复，微波处理，解冻档5～6min；滴加3％H2O2, 37℃，10min；滴加血清封闭，37℃，15min；滴加一抗（一抗稀释度为c-fos 1：100, caspase-3 1:50），37℃， 2h；PBS洗3次×3min；滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃，20min；PBS洗3次×3min；滴加标有辣根过氧化物酶的链酶亲和素，37℃， 20min；PBS洗3次×3min；DAB显色；苏木素复染核；中性树胶封片。同时用已知的阳性切片做阳性对照,以PBS取代一抗做阴性空白对照。光镜下观察，c-fos 阳性表达神经元为胞核呈棕黄色，核仁不着色；caspase-3阳性表达神经元为胞浆和胞膜呈棕黄色。

    1.9  图像分析  采用图像分析仪，每张切片选取海马CA3区四周及中央区域，200倍镜下测定其c-fos和caspase-3蛋白的阳性细胞数，平均灰度值等指标，各取平均值作为这张切片的值。由同一人用同一台仪器测定。

    1.10  统计学处理  采用SPSS 14.0 统计软件包进行分析，结果以均数±标准差表示，组间检验采用t检验。

    2  结果

    2.1  体重和开场行为评定  见表1。从表1可以看出, 实验组与对照组实验前开场行为和体重差异无显著性(P>0.05), 实验组实验前和实验后开场行为中,除粪便粒数外, 各指标差异有显著或非常显著性(P<0.05或P<0.01), 体重也较实验前减轻(P<0.05); 对照组实验前后开场行为也有部分改变(P<0.05或P<0.01), 体重较实验前增加(P<0.01); 实验组与对照组于实验后比较, 除修饰次数差异无显著性, 其余各指标对照组都优于实验组(P<0.05或P<0.01)。

    2.2  c-fos和caspase-3蛋白的图像分析结果  见表2。从表2可见，c-fos蛋白的图像分析结果中，平均灰度值两组比较差异有非常显著性（P=0.000），两组阳性单位数比较，P=0.000, 说明实验组与对照组在c-fos的表达上存在明显的差异。caspase-3的图像分析结果中，平均灰度值和阳性细胞数实验组与对照组差异均有极显著性（P=0.000）, 说明慢性应激老年大鼠c-fos、caspase-3蛋白表达较正常对照组有显著增强。表2  c-fos 和caspase-3蛋白的图像分析结果注: 与对照组比较, P=0.000。

    2.3  c-fos、caspase-3蛋白免疫组化染色  见图1～8。

    图1～4为实验组和对照组c-fos 蛋白免疫组化光镜照片，以胞核内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞，结果可见，在相同观察条件下，实验组阳性细胞数较对照组显著增多，提示慢性应激状态下老年大鼠c-fos 蛋白表达较正常组有明显增强。

    图5～8为实验组和对照组caspase-3免疫组化光镜照片，以胞浆内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞，在相同观察条件下，可见实验组阳性细胞数较对照组显著增多，同样提示慢性应激老年大鼠海马CA3区caspase-3 蛋白表达活跃。

    3  讨论

    慢性应激能导致抑郁症发病，已经多数研究得到证实，然而对于其发病机制尚存在不同观点，一般认为，在慢性应激过程中，多种神经元保护机制的缺失，神经元细胞凋亡的活跃，是导致大脑器质性损害的主要原因［6］，老年人由于身体机能下降, 抗损害能力也相应下降,细胞凋亡增加, 对慢性应激的耐受更差, 因此, 探讨慢性应激所致细胞凋亡与抑郁症发病的关系, 对于从细胞凋亡角度防治老年抑郁症具有重要作用。

    利用强迫老年大鼠游泳和不可预见性中等强度刺激，经21天后，实验组大鼠行为学发生明显变化：实验组大鼠中央格停留时间延长，水平穿越格数减少，修饰行为减少，排便次数增多，对实验前、后动物开场行为进行评定，结果实验前实验组与对照组差异无显著性，实验后两组动物行为差异有显著性，说明该种动物模型的制作是成功的。实验同时发现，对照组大鼠在实验前后行为学上也发生了一些改变，如中央格停留时间、水平穿越格数、修饰行为等等，可能与经过21天实验，老年大鼠对环境新鲜感和满意程度都有所减退，且与实验对象本身为老年大鼠, 随着年龄增加，运动功能有所减退有关，但粪便粒数无显著变化，体重有所增加，又说明老年大鼠认知能力和紧张程度无明显变化。

    caspases即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，caspase的超表达和激活可导致细胞凋亡的发生，因此caspase又被称为死亡蛋白酶，其中caspase-3是介导细胞凋亡的核心蛋白酶 ［7～8］；c-fos 蛋白的表达与机体受到的损害刺激有关，研究显示，当机体遭受疼痛、缺氧、寒冷等刺激时，激活相关部位的痛感受性神经元，c-fos原癌基因启动，c-fos 蛋白的表达增加，启动caspase级联反应，最终激活caspase-3，导致细胞凋亡［9～11］。本实验结果发现，经21天慢性刺激的老年大鼠，其大脑海马区c-fos和caspase-3蛋白的表达均显著增强，表明慢性刺激导致了c-fos原癌基因启动并通过级联效应导致caspase-3的高表达，从而导致脑细胞凋亡，提示细胞凋亡增加在抑郁症发病中起一定作用。该研究为选用抗caspase和抑制原癌基因药物治疗老年抑郁症提供了一些实验依据，然而，这一结果还只是初步的，需要进一步的研究证实。

    （本文图片见封三）

【参考文献】
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11 Lucassen PJ, Vollmann-Hocedorf GK, Gleisberg M, et al. Chronic psychosocial stress differentially affects apoptosis in hippocampal subregions and cortex of the adult tree shrew. Eur J Neurosci, 2001, 14(1): 161-169.

（编辑：齐 永)

作者单位：1 200137 上海， 上海市第七人民医院肿瘤老年科（△通讯作者） 2 湖北武汉，武汉大学医学院实验中心