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【摘要】 目的 观察精浆弹性硬蛋白酶在男性不育症的变化，探讨精浆弹性硬蛋白酶值与CASA有关参数之间的关系。 方法 2005年11月～2006年5月至我院男科门诊就诊的96例男性不育症患者，年龄22～43岁，平均29.87岁。采用精浆弹性硬蛋白酶定量检测和DNA荧光染色精子动（静）态图像分析系统进行检测分析。 结果 完成的96例患者中，共有14例发现精浆弹性硬蛋白酶值异常，占14.58％。 结论 精浆弹性硬蛋白酶的检测是一项对判断精子生育力有价值的指标。
【关键词】 精浆弹性硬蛋白酶; 男性不育症
Clinical analysis of seminal plasma neutrophil elastase of sterile male (reports of 96 cases)
BIAN Ting-song，XU Fu-song，YANG Guang，et al. Department of Andrology，Changzhou Hospital Affiliated to Nanjing University of TCM，Changzhou 213003，China
【Abstract】 Objective To observe the change of seminal plasma neutrophil elastase in male infertility patients, study the relationship of seminal plasma neutrophil elastase and seminal parameter in these patients. Methods The 96 cases with male infertility patients were observed by seminal plasma neutruphil elastase assay and were analyzed by computer assisted sperm analysis system. Results There are 14 cases of abnormal seminal plasma neutrophil elastase were found in these infertility patients, about 14.58%. Conclusion The seminal plasma neutruphil elastase assay is a important method on male infertility.
【Key words】 male sterility; seminal plasma neutrophil elastase
男性生殖道感染为男性不育的重要病因，占男性不育的4%～10%［1］。近年来，随着性传播疾病的蔓延，同时由于亚临床和隐性感染的增多，对男性生殖道感染的实验室诊断就显得尤为重要。检测精液中的中性粒细胞弹性硬蛋白酶(neutrophil elastase，NE)水平对诊断男性生殖道感染有重要的临床价值。本文阐述运用精浆弹性硬蛋白酶定量检测男性不育症研究结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 精液 男性不育症患者96例，均来自南京中医药大学附属常州中医院男科门诊患者，年龄22～43岁，平均29.3岁。对符合以下条件的96例患者进行精浆弹性硬蛋白酶定量检测：身体健康，婚后正常性生活2年以上不育，性功能正常；无外伤及遗传性疾病家族史，体检未发现有明显睾丸、副睾及输精管异常。无全身和内分泌疾病。精液常规检查，取精前均禁欲３～５天，手淫取精，精液置３６℃ 恒温箱直至液化，采用DNA荧光染色精子动（静）态图像 分析系统进行精液参数分析（北京航天瑞祺科技发展有限公司）。
1.2 主要试剂 精浆弹性硬蛋白酶定量检测试剂盒，购自深圳华康生物医学工程有限公 司，批号：20051201。
1.3 方法
1.3.1 精浆弹性硬蛋白酶定量检测 取同次精液进行精浆弹性硬蛋白酶检测，步骤： (1) 准备适当数量的包 被微孔。标准品、稀释标本加样量均为100μl/孔。五个标准品浓度依次为3000、1500、750、375和0ng/ml（以标本稀释液作为0标准）。(2) 用封片膜封板。以孵育振荡器（350～400rpm）室温（18～28℃）反应60min。(3) 弃去封板膜。洗板：以洗涤液注满微孔，每次浸泡1min，共洗板5次。扣干。(4) 每孔加酶结合物100μl。用封板膜封板。以孵育振荡器（350～400rpm）室温（18～28℃）反应45min。(5) 弃去封板膜。洗板：以洗涤液注满微孔，每次浸泡1min，共洗板5次。扣干。(6) 每孔加显色液100μl，室温避光反应20min［显色液临用前配制。方法是：显色剂A：显色剂B按体积比40：1混合（如显色剂A 400μl + 显色剂B 10μl）,显色液配制后30min内使用］。(7) 每孔加终止液100μl，充分混匀。15min内上酶标仪双波长450/630nm比色。
1.3.2 判断标准 <290ng/ml，隐性感染：290～1000ng/ml，确证感染：>1000ng/ml。
1．4 统计学分析 采用SPSS11.0软件包进行统计分析，检测数据用x±s表示，均值比较采用t检验，P<0.01被认为差异有显著性。
2 结果
2005年11月～2006年5月至我院男科门诊就诊的96例患者，年龄22～43岁，平均29.87岁。其中精子密度>20×106者72例，精子密度<20×106者24例；精子活力a<25％者58例，a＋b<50％者82例。本组96例患者中，精浆弹性硬蛋白酶值<290ng/ml 者82例，在290～1000ng/ml者5例，>1000ng/ml者9例，共有14例发现精浆弹性硬蛋白酶值异常，占14.28％。精浆弹性硬蛋白酶值正常组和异常组患者的精子密度、a级精子、ａ＋ｂ级精子等主要精液参数指标，均P>0.05，而精浆弹性硬蛋白酶值有统计学意义。见表1。 表1 96例男性不育症患者精液参数和精浆弹性硬蛋白酶的比较 注:*P<0.01
3 讨论
弹性硬蛋白酶是机体内能水解弹性蛋白的酶。分布于中性粒细胞、巨噬细胞等多种组织和细胞中。存在于中性粒细胞中的弹性硬蛋白酶称为NE。NE是一种丝氨酸中性蛋白水解酶，无前体酶。适宜pH值为7.15～8.5，主要存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中。核膜和高尔基体等细胞器中也有少量分布［2］。
精子在病原微生物传播过程中起着关键作用。这些微生物体能粘附在精子上。能改变精子的新陈代谢及膜通透性。当生殖道感染时吞噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞等释放大量的趋化因子，如IL28、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL26和IL21等，这些物质可吸引中性粒细胞在生殖道炎性部位聚集，并吸附在毛细血管内皮细胞上而激活和脱颗粒。Eggert-Kruse等［3］研究证实： IL28的浓度与白细胞精子症病人精液中性粒细胞的数量、精浆NE水平均有很好的相关性。同时，IL26、C3的水平也与IL28有很好相关性。但IL26在精浆中的浓度较低。
中性粒细胞以防御细胞和炎性细胞的双重角色参与男性生殖道感染的发生、发展。中性粒细胞的过度浸润或过度释放溶酶体酶(如弹性硬蛋白酶)、超氧阴离子等炎性介质，可能是男性生殖道感染进一步恶化的一个重要病理机制［4］。生殖道感染时，精液中的WBC增加，中性粒细胞是精液中的优势细胞［5］。精液中NE主要来源于中性粒细胞的嗜天青颗粒。Wolff等［6］发现： NE与WBC有明显的相关性。目前已将NE>1000ng/ml作为诊断白细胞精子症的又一诊断标准［7］。Gustafsson等［8］首先提出以往测定的NE水平实际上是其总水平，由细胞外NE和细胞内NE共同组成。细胞外NE是中性粒细胞吞噬、脱颗粒时释放的一部分，它不仅与中性粒细胞数目有关，而且与炎性程度有关。细胞内NE是存在于中性粒细胞中的一部分，作为粒细胞的潜在活性与中性粒细胞的数目一致。
中性粒细胞NE与巨噬细胞分泌的NE(金属蛋白酶)不同。NE在男性生殖道感染的作用机制主要为以下几点［9,10］：(1)NE的溶解作用；(2)NE与粒细胞的趋化；(3)NE与抗蛋白酶的失衡。
精浆中的NE在诊断白细胞精子症和细菌性前列腺炎有较好的特异性［11］。同时，NE可以提示附属性腺的炎症，附性腺炎症能导致精液液化异常。
精浆中的果糖、柠檬酸、α-葡糖苷酶分别是精囊腺、前列腺、附睾的特异性生化指标，分别反映了相应腺体的分泌功能。Wolff等［12］检测时发现：精浆中高NE水平与低柠檬酸水平呈高度相关性，而与果糖、α-葡糖苷酶水平降低无明显相关性。
Zorn等［1，13］研究证明：在不育人群中有34%NE水平升高，明显高于生育组的5%；精浆中的NE水平与病人年龄及精浆中的白细胞数呈正相关，与病人的精液量及精子单链DNA的比例呈负相关。同时还发现：较高的NE水平常常与病人配偶的生殖道感染有关，经抗生素治疗后25%的不育病人NE水平有所下降，配偶有生殖道感染时，会明显影响治疗效果，那么夫妇两方必须同时接受治疗。
由于炎症过程中众多因子的相互作用使得炎症过程对精子特性的影响不一致［14］；但一些学者并没有观察到弹性硬蛋白酶水平与精子特征的相关性［1］。我们的研究结果也表明：精浆弹性硬蛋白酶值正常组和异常组的精液参数没有统计学意义。
在男性不育症中，生殖道炎症往往是隐匿性的，在一些精液参数异常和功能异常的不育症患者，应当考虑患者是否存在生殖道感染［15］。由于精液中WBC的计数不容易，对区别分叶核粒细胞和单核细胞与不成熟的精子细胞比较困难；因此，精浆中弹性硬蛋白酶检测显得尤其重要。
急性炎症时，弹性硬蛋白酶复合物浓度迅速从正常水平升高超过290ng/ml［1］，直到炎症被治愈，否则还是保持高水平。当临床上检查到有微生物感染，炎症即可被诊断。弹性硬蛋白酶的检测显得多余，抗炎治疗后弹性硬蛋白酶水平降低表明治疗效果有效；如果弹性硬蛋白酶水平没有下降，则治疗方案应该重新考虑，提示医生要找出其他慢性炎症病灶［1］。
经过ROC线性分析，在诊断男性生殖道隐性感染时，建立NE≥290ng/ml的临界值比较有效，其敏感性为79.5%，特异性为74.4%。所以，弹性硬蛋白酶浓度低于250ng/ml时，提示正常，无炎症存在；290～1000ng/ml时，为中度炎症；大于1000ng/ml时，为重度炎症［13］。精浆中的NE水平可以作为筛选和诊断男性生殖道感染的客观而有效的指标。
Reinhardt等［16］证实，男性生殖道隐性感染可以通过定量检测精浆中的NE水平来诊断。NE水平的定量检测在区分附属性腺与非附属性腺感染中有高特异性和敏感性。NE水平的定期检测不仅可以观察抗炎疗效，而且还可以监测男性生殖道感染的病情发展。
应用弹性硬蛋白酶的检测方法也存在局限性。应用ELISA法只能检测细胞外的弹性硬蛋白酶。其中20%的白细胞精子症男性的弹性硬蛋白酶低于临界值；另外，20%高浓度弹性硬蛋白酶的精液标本没有表现为白细胞精子症［1］。
综上所述，依照WHO推荐的标准，精浆弹性硬蛋白酶检测是一种敏感、特异性炎症指标［17］。由于精液弹性硬蛋白酶水平检测的可靠性、易操作性，临床上可作为男科实验室筛选和诊断生殖道炎症和和判断预后的客观而有效的指标。同时我们在检测弹性硬蛋白酶时应该结合其他的常规男性实验室项目来综合评价。
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(编辑：齐 永)
*基金项目：江苏省中医药管理局立项课题（项目编号：H05117）
作者单位：1 213003 江苏常州,南京中医药大学附属常州中医院 2 210029 江苏南京,江苏省中医院