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【摘要】 目的 探讨原癌基因c-myc、c-fos与良性胆道狭窄形成的相关性。进一步阐明良性胆道狭窄中胆管瘢痕的发生机制。方法 应用免疫组化SP法，检测c-myc、c-fos蛋白在肝内、外胆管瘢痕组织中的表达和分布。对其阳性表达结果进行比较分析。结果 肝内、外胆管瘢痕组织的成纤维细胞、胆管上皮细胞及血管内皮细胞中c-myc、c-fos呈强阳性表达，而正常胆管组织中缺乏表达。结论 肝内、外胆管瘢痕组织中c-myc和c-fos癌基因受激活，可能参与了成纤维细胞的分化增殖、胶原合成与降解以及对细胞因子的调控，并导致瘢痕增生。原癌基因c-myc、c-fos与良性胆道狭窄瘢痕形成密切相关。c-myc与c-fos蛋白两者的表达成正相关，两者具有协同性。
【关键词】 原癌基因c-myc 原癌基因c-fos 良性胆管狭窄 胆管瘢痕
Expression of c-myc、c-fos in scartissue of benign biliary stricture and correlation investigation
LU Hui，ZHANG Xiao-wen,LIU Wen-yong.Department of Surgery,Fengcheng Hospital,Shanghai 201411,China
【Abstract】 Objective To observe the expression and distribution of c-myc and c-fos in biliary scar tissue, to investigate the correlation between expression of key pro-oncogenes and benign biliary stricture. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression and distribution of c-myc、c-fos proteins on extrahepatic bile duct scar tissue、intrahepatic bile duct scar tissue and normal bile duct tissue. Results c-myc and c-fos expression on the nucleus of fibroblast、epithelial cell and endothelial cell of biliary scar tissues were significantly higher than normal biliary tissue. And there was obviously difference between scar tissue and normal tissue.Conclusion c-myc and c-fos oncogenes are activated on biliary scar tissues,which may contribute to proliferation and differentiation of fibroblasts、synthesis and degradation of collagen and regulation of cytokines and induce abnormal scarring.There was close corralation between c-myc、c-fos proto-oncogenes and benign biliary stricture scar tissue.there were positive correlations and co-operativity between c-myc and c-fos expression.
【Key words】 proto-oncogenes c-myc；proto-oncogenes c-fos；benign biliary stricture；bile duct scar
胆道狭窄一直是胆道外科领域中病变复杂处理困难的课题。 近来一些研究表明， 部分原癌基因在组织再生等过程中常被激活， 可能通过调控某些细胞因子来控制病理性瘢痕增生。 但对于在胆道瘢痕的形成过程中,原癌基因是否参与调控及表达尚不清楚。 本研究探讨了肝内、 外胆管瘢痕组织中c-myc和c-fos蛋白的表达及c-myc、 c-fos的表达与胆管瘢痕形成的相关性。 试从分子水平来了解良性胆道狭窄形成机制， 为临床防治胆管瘢痕提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集昆明医学院第二附属医院2000年1月～2005年6月，手术治疗经病理科证实的肝外狭窄胆管瘢痕标本20例，其中男12例，女8例。肝内狭窄胆管瘢痕标本12例。正常胆管组织取自肝移植供体的肝外胆管6例，意外死亡的健康成人肝外胆管4例,共10例。
1.2 c-myc和c-fos蛋白表达的检测 免疫组化采用SP法。标本全部用10%甲醛溶液固定,石蜡包埋后连续切片，片厚5μｍ。切片经二甲苯脱蜡、H2O2室温灭活内源性酶、修复抗原、正常血清封闭、滴加一抗、4℃过夜、DAB显色、苏木素衬染、脱水、透明、封片等处理。工作浓度：c-myc1：50、c-fos1：50。鼠抗人c-myc单克隆抗体、鼠抗人c-fos单克隆抗体及免疫组化法染色试剂购自福州迈新生物技术公司产品。以已知阳性切片作为阳性对照，以PBS液（pH 7.4）代替一抗作为每一次染色的阴性对照。
1.3 结果判断 参照1996年全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会意见：细胞质或核内见淡黄色颗粒明显高于背景色为阳性细胞。阳性细胞评定标准:c-myc、c-fos 主要以细胞核染成棕黄色为阳性细胞。细胞的着色强度可分为以下级数:“-”为阴性细胞;“+”为细胞核和（或）细胞质染成淡棕黄色;“+++” 为深棕黄色;“++”则介于两者之间。每例标本随机取5个高倍（100倍）视野观察和计数阳性细胞,计算出平均值。
1.4 统计学处理 数据用均数±标准差（x±s）表示，采用非参数检验中Kruskal-Wallis Test和Man-Whitney Test 进行多组间的比较。α= 0.05,P<0.05表示两组差异有显著性。采用Spearman相关分析进行c-myc和c-fos表达关系的分析。统计学处理应用SPSS 10.0软件系统,计算机处理。
2 结果
2.1 形态学观察 正常胆管组织c-myc蛋白无表达或极少量表达,淡染。在肝内、外胆管瘢痕组织中表达呈强阳性,阳性细胞呈棕黄色，主要定位于细胞核，细胞质中少量弱阳性表达，在胆管上皮细胞、血管内皮细胞、增生的成纤维细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中均有强阳性表达(见图1、2)，两者的分布较一致，阴性对照片不着色。c-fos蛋白阳性分布与c-myc蛋白较一致 (见图3、4)。
2.2 组织切片c-myc、c-fos蛋白定量分析 每张组织切片在高倍镜下（×100）随机选择5个视野，计数c-myc、c-fos蛋白表达的阳性细胞数，计算出平均值。数据经统计分析，发现两指标中，肝内、外胆管瘢痕组织表达均较高，正常胆管组织表达最弱。经两两比较，肝内、外胆管瘢痕组间差异无显著性(P>0.05)，而两组与正常胆管对照组比较差异均有非常显著性(P<0.01）,见表1。 表1 各组中c-myc、c-fos蛋白定量分析结果 注：与正常胆管对照组比较，*P<0.01
2.3 c-myc与c-fos蛋白表达的关系 Spearman相关分析表明：在肝外胆管瘢痕组中c-myc与c-fos蛋白两者的表达成正相关(r=0.75,P<0.05)。在肝内胆管瘢痕组中c-myc与c-fos蛋白两者的表达亦成正相关(r = 0.68,P<0.05)。即在c-myc蛋白高表达的同一病变组织中，c-fos蛋白亦为高表达；c-myc蛋白低表达的同一病变组织中，c-fos蛋白亦为低表达。见图5、6。图5 肝外胆管瘢痕组中c-myc与c-fos
3 讨论
良性胆道狭窄指因各种非肿瘤性病变致胆管纤维性狭窄（胆总管直径小于0.5cm，左右肝管直径小于0.3cm），引起黄疸、胆绞痛或胆管炎。本试验中所采用的病变组标本主要来源于两种情况：（1）炎症性胆管狭窄；（2）损伤性胆管狭窄。并按部位分成肝外胆管瘢痕及肝内胆管瘢痕。
目前在烧伤、整形中对病理性瘢痕的研究成果表明原癌基因的表达可能通过调控某些细胞因子来控制病理性瘢痕增生。胆管瘢痕狭窄是由于病理性瘢痕增生引起，对良性胆道狭窄的相关基因的研究，国内外还鲜有报道。
笔者的研究结果表明：c-myc、c-fos蛋白在肝内外胆管瘢痕组织的胆管上皮细胞、增生的成纤维细胞、血管内皮细胞及一些炎症细胞中均有强阳性表达，主要定位于细胞核，细胞质中少量弱阳性表达，对照组表达较弱，甚至无表达。说明原癌基因c-myc、c-fos与胆管瘢痕形成有密切的关系。胆管瘢痕组织中有慢性炎症的持续存在、局部组织血供不良及胶原纤维过度沉积，改建较差等。胆汁中的胆盐、卵磷脂，胆肠吻合后的肠液反流会引起CD68(巨噬细胞)的高表达，巨噬细胞释放促纤维生长因子包括转化生长因子β1、血小板衍化生长因子、表皮生长因子等和酶类包括胶原酶、弹性蛋白酶、纤溶酶原激活物等参与对成纤维细胞增殖和胶原合成的调节。以上各种刺激引起c-myc原癌基因表达后，可以促进细胞由静止期（G0期）而进入分裂期（S期）促进细胞的分裂增殖。c-myc原癌基因表达的蛋白定位于核内，与某些癌基因协调转化细胞，最终使细胞进入S期。c-myc基因参与了此过程并起重要作用。尤其是细胞从G0期进入G1期的过程。c-myc原癌基因表达与多种生长因子在调控创面修复方面有相互影响的作用，它们相互协调控制，共同作用影响组织的修复增生［1～4］。在正常的胆管组织中，c-fos基因仅呈极低水平表达。但在异常的情况下，如胆管组织的炎症、局部缺氧及胆汁中的胆盐等因素的刺激，c-fos能迅速表达，其编码的细胞核磷酸蛋白具有ＤＮＡ结合活性,被看作是细胞核内的“第三信使”。c-fos能使细胞由G0期启动而进入细胞周期。在细胞周期中,细胞周期蛋白与相应的细胞周期依赖蛋白激酶结合,经磷酸化/脱磷酸化修饰后具有活性,促使与周期有关的蛋白基因如fos等IEGs表达,控制细胞周期的进程，从而促进胆管组织中成纤维细胞等的增殖与合成。
在组织修复过程中，c-myc、c-fos和某些相关的细胞因子表达存在相互的网络调控作用，并由此影响修复细胞的增殖与分化。以往的研究表明巨噬细胞、转化生长因子-β1高表达是造成胆道愈合过程成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、瘢痕增生的重要因素。本文的试验也表明，c-myc和c-fos蛋白表达的细胞定位、阳性信号形态及强度较多相似。通过Spearman相关分析表明两者成正相关关系，说明两者在促进瘢痕形成的过程中是相互协同作用的。c-myc和c-fos的激活和协同作用可能参与了成纤维细胞的增殖甚至表型的转化，或胶原合成与降解及细胞因子的调控过程［5］。并导致异常的瘢痕增生。c-myc和c-fos蛋白的高表达与良性胆管狭窄的瘢痕组织纤维化的发生有着密切的关系。而c-myc和c-fos原癌基因受激活，可能参与了对细胞因子活动的调控，原癌基因与细胞因子之间的确切关系,有待于我们进一步的探索和研究。
【参考文献】
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5 胡振富，罗力生，罗盛康.病理性瘢痕中C-myc、C-fos和ras原癌基因表达的实验研究.中华整形外科杂志,2002,18(3):165-167.
作者单位：201411 上海，上海市奉贤区奉城医院外科