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首页医源资料库在线期刊中华医学实践杂志2008年第7卷第2期

肠粘连组织中MMP-3和TIMP-1的表达及意义

来源:《中华医学实践杂志》
摘要:【摘要】目的观察MMP-3和TIMP-1与肠粘连的相关性及意义。方法选取60只SD雄大鼠随机分为两组(n=30),B组制成大鼠肠粘连模型,A组为正常对照组,分别于造模第2、7、14天各处死10只,分别取小肠浆膜粘连,应用免疫组化和图像分析的方法测定粘连组织中MMP-3和TIMP-1蛋白的表达。结果术后2天组,粘连组织中MMP-3......

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【摘要】  目的 观察MMP-3和TIMP-1与肠粘连的相关性及意义。方法 选取60只SD雄大鼠随机分为两组(n=30),B组制成大鼠肠粘连模型,A组为正常对照组,分别于造模第2、7、14天各处死10只,分别取小肠浆膜粘连,应用免疫组化和图像分析的方法测定粘连组织中MMP-3和TIMP-1蛋白的表达。结果 术后2天组,粘连组织中MMP-3和TIMP-1的含量升高,与正常对照组相比,差异有显著性(P<0.01);术后7天组,粘连组织中MMP-3含量降低;而TIMP-1的含量升高至峰值,与术后2天组相比,差异有显著性(P<0.01);术后14天组,粘连组织中MMP-3含量继续降低,TIMP-1的含量略为下降,但两者含量都已基本稳定。与术后7天组及术后2天组相比,差异均有显著性(P<0.05,P<0.01)。结论 MMP-3、TIMP-1在手术后不同时期的不同表达可能在肠粘连的形成中发挥一定作用。

【关键词】  基质金属蛋白酶-3;组织金属蛋白酶抑制剂-1;肠粘连


    Expression and significance of matrix metalloproteinase-3 and it’s tissue inhibitors of metalloproteinase-1 in intestinal adhesive tissues

    LIN Hong,LI Na,GUO Xin-hua. Laoshan District Woman Children Health Care Hospital, Qingdao 266101,China

    【Abstract】  Objective  To study the clinical significance and correlation of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1(TIMP-1) in intestinal adhesion. Methods  Sixty SD male rats were randomly allocated to two groups, B group was 30 rats with postoperative intestinal adhesion ,A group was normal. Ten experimental rats were sacrificed on the 2nd,7th and 14th day after injection, respectively. Take adhesive tissue of small intestine respectively, the expression of MMP-3 and TIMP-1 in adhesive tissues were determined by immunohistochemistry assay and image analysis. Results  The expression of MMP-3 and TIMP-1 in adhesive tissues on the 2 day after surgery were significantly higher than those of normal group(P<0.01); MMP-3 contents in adhesive tissues on the 7 day after surgery were significantly lower than the 2 day after surgery(P<0.01);but the peak time of TIMP-1 contents was on the 7 day after surgery; MMP-3 contents in adhesive tissues continued to lower on the 14 day, TIMP-1 contents descended just a little, but both of their contents had been basic stability already. Compare to the group of 7 day after surgery and that of 2 day after surgery, there was significant difference(P<0.05,P<0.01).Conclusion  The different expression of MMP-3 and TIMP-1 in different period after operation might play a role in intestinal adhesion formation.

    【Key words】  matrix metallo proteinase-3(MMP-3);tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1(TIMP-1);intestinal adhesion

    随着科学技术的不断进步,现代外科手术的技术和方法也正在日新月异地向前发展,但盆腹部手术后盆腹腔粘连(主要是肠粘连)仍是亟待解决的外科难题。就盆腔粘连来说,它是妇科手术后常见的并发症之一,发生于2/3开腹术患者中。盆腔粘连不仅是急性复发性肠梗阻最常见的原因(20%~41%),并与15%~20%妇女直接不育相关,也是妇女生育重建手术失败的重要原因,还可以引起性生活不适、慢性盆腔痛等。不仅如此,盆腹腔粘连使二次手术率提高,造成二次手术的费时、困难、危险乃至致命的出血。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)可降解各类胶原、蛋白多糖及基质蛋白,其作用可被组织蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)所抑制[1]。近年来发现MMPs 和TIMPs 与腹腔粘连具有密切关系[2]。MMP和TIMP在创伤愈合过程中可降解细胞外基质,促进细胞外基质的更新[3]。基质金属蛋白酶-3(MMP-3)在创伤愈合过程中具有一定的作用[4]。本研究旨在探讨MMP-3、TIMP-1和肠粘连的相关性,探讨预防术后肠粘连的有效办法,为指导治疗提供一条新思路。

    1  材料与方法

    1.1  研究材料  60只SD雄大鼠A、B两组各30只,其中A组为对照组,B 组制成肠粘连模型。

    1.2  研究方法  B组动物均用2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉。动物麻醉后仰卧位固定,剪毛消毒,无菌操作下取下腹正中切口,长约3cm,打开腹腔后找出回盲部,距回盲部5cm处取10 cm长的一段回肠,用干纱布反复轻轻擦拭小肠浆膜层使浆膜受损(约0.4cm×10cm),表面有针尖状出血点。再滴一滴无水乙醇于创面上,无齿镊夹持盲肠系膜动脉2min,使局部缺血。然后将其放回腹腔,逐层关腹。术后动物禁食12h,分笼饲养,饲料为全价营养大鼠颗粒饲料。分别于造模后2、7、14天后再以2%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后,开腹检验、取材,每个时相点各取10只动物。A组SD雄大鼠30只,与模型组一样麻醉、开腹,但不动肠组织,直接关腹,分别于术后2、7、14天开腹取肠组织。

    检测肠粘连情况:参照Phillips分级标准,根据具体情况评定肠粘连程度。0级:完全无粘连,回肠浆膜面修复良好;I级:回肠与周围组织少量粘连,疏松易分离,无渗血;Ⅱ级:回肠与周围组织轻到中度粘连,肠管可呈“U”形,分离时局部有渗血;Ⅲ级:肠管与周围组织广泛粘连,较难分离,无肠梗阻;Ⅳ级:肠管与周围组织紧密粘连成团,分离困难,引起肠梗阻。

    1.3  组织切片的免疫组织化学检测

    1.3.1  免疫组化试剂与来源  P-gp TOPOII、GST-π、LRP单克隆抗体,SP-KITT9000试剂盒均由美国ZYMED公司提供,防脱片剂APES、显色剂DAB为北京中山生物技术有限公司产品。

    1.3.2  组织切片的制备  每组取大鼠的创面部位肠管0.5cm,所有标本经10%的中性福尔马林固定,石蜡包埋切片,冰箱冷冻。将石蜡切片近小肠浆膜组织处行4μm连续切片后,采用免疫组织化学S-P法筛查组织标本中MMP-3、TIMP-1。主要操作步骤如下:石蜡切片脱蜡和水化后PBS冲洗,微波修复抗原,加过氧化酶阻断液,室温下孵育10min,加正常山羊血清,孵育20min;滴加浓度为1:100的Ⅰ抗,37℃孵育12h,用0.1M的PBS缓冲液冲洗。滴加Ⅱ抗,37℃孵育30min,用0.1M的PBS缓冲液冲洗。滴加DAB显色剂在室温下显色,苏木素复染。

    1.4  免疫组化染色结果的判断标准  采用免疫组化染色结合图像分析进行。用低倍镜和高倍镜观察切片,阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰,细胞浆中存在粗细一致的棕黄色颗粒,染色明显高于背景。见图1,图2。

    图像分析方法为:从每张免疫组化染色片中随机选取5个视野,输入TECBIAS-6803真彩色生物医学图像分析系统,测量平均光密度值和面积之乘积,以此反映MMP-3含量的变化。

    1.5  统计学处理  实验结果皆以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS11.0版软件进行单因素多个样本均数比较的方差分析。

    2  结果

    见表1。表1  MMP-3与TIMP-1在组织中的表达(略)注:MMP-3的含量:各组与正常对照组比较,P<0.01;与术后2天组比较,aP<0.01 ,aaaP<0.01;与术后7天组比较,aaP<0.01。TIMP-1的含量:各组与正常对照组比较,P<0.01;与术后2天组比较,bP<0.01 ,bbbP<0.01;与术后7天组比较,bbP<0.05

    3  讨论

    3.1  MMP-3及TIMP-1的生物学特性  细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是近年来细胞分子生物学研究的重要内容,位于上皮或内皮细胞下层、结缔组织周围的物质,包括基底膜和间质性结缔组织。其成分大体分为胶原、蛋白聚糖和糖蛋白。基质金属蛋白酶(MMPs)是由成纤维细胞、毛细血管内皮细胞及结缔组织细胞等产生的一组在结构上具有极大同源性,能降解几乎所有细胞外基质成分的酶。主要参与组织的重建与修复、伤口愈合、炎症反应等[5]。根据其作用的底物不同,基质金属蛋白酶主要分为胶原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)、基质溶解素(MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11)、明胶酶(MMP-2、MMP-9)等亚家族 。基质金属蛋白酶-3广泛存在于多种组织及细胞中,MMP-3降解底物为蛋白聚糖、明胶、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅸ型胶原等[6]。组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)是一种M为58000的糖蛋白,是基质金属蛋白酶MMP-3的特异性抑制剂,在正常情况下,基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂之间存在着一种精细的平衡,组织金属蛋白酶抑制剂可以通过其氨基酸末端决定簇与基质金属蛋白酶按1:1的比例结合,从而阻断后者的活性,因此,它是组织局部基质金属蛋白酶活性最重要的调节因素[7] 。

    3.2  MMP-3、TIMP-1与肠粘连的关系  研究发现,腹膜间皮细胞、成纤维细胞和各种腹腔脏器的浆膜组织中,存在MMPs和TIMPs的活性表达,提示这是一个部分影响腹膜组织修复和粘连形成的因素[8]。而且,大多数MMPs的表达是由细胞因子、激素、生长因子及细胞转化来转录调节的。其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)上调MMP-3的表达,转化生长因子-β(TGF-β)下调MMP-3的表达[9]。 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)是腹腔粘连中起主要作用的细胞因子。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的主要作用是介导炎症的细胞因子,在体内炎症前期有一定的介导作用;转化生长因子-β(TGF-β)是启动和终止组织修复的主要细胞因子,调节损伤组织重建的全过程[10]。这一结果提示在损伤早期,肿瘤坏死因子-α起主要作用;而在损伤组织重建时,转化生长因子-β起主要作用。因此,在损伤早期,肿瘤坏死因子-α上调MMP-3的表达,使MMP-3含量升高,MMP-3降解细胞外基质的胶原,减少粘连形成,因此在损伤早期较少有粘连形成。以后随着组织重建的启动,转化生长因子-β逐渐起主要作用,下调MMP-3的表达,上调TIMP-1的表达[8],使MMP-3的含量逐渐降低,因而,细胞外基质的胶原不能被分解而永久沉积下来形成粘连。

    本实验显示,MMP-3从组织损伤至肠粘连形成过程中经历了一个由升高到逐渐下降的过程,峰值在术后2天;TIMP-1则持续升高,峰值在术后7天,术后14天组较峰值略为降低。各组间两两比较,差异有显著性(P<0.01)。提示MMP-3、TIMP-1的含量与肠粘连密切相关。

    术后2天组MMP-3和TIMP-1在组织中的含量高于正常对照组,差异有显著性(P<0.01)。此时,由于介导炎症的细胞因子—肿瘤坏死因子-α(TNF-α)起主要作用,上调MMP-3的表达,使MMP-3的含量升高;可能早期的组织损伤改变了MMPs 和 TIMPs的表达,TIMP-1的含量同步升高,以达到抑制MMP-3表达的作用。由于大量MMP-3不能被及时抑制,它分解细胞外基质的胶原,此时粘连形成较轻。此时,MMP-3/ TIMP-1≈1:1,基本与正常对照组比例相同,在一个正常范围内,在此阶段,无粘连形成或粘连形成轻。

    术后7天组,组织中MMP-3含量降低,而TIMP1的含量升高至峰值,与术后2天组相比,差异有显著性(P值均小于0.01)。术后7天,随着组织重建的启动,肿瘤坏死因子-α的作用逐渐弱化,转化生长因子-β逐渐起主要作用,转化生长因子-β下调MMP-3的表达,上调TIMP-1的表达,使MMP-3的含量逐渐降低,TIMP-1的含量达峰值,由于TIMP-1对MMP-3表达的抑制作用,TIMP-1进一步抑制MMP-3的表达,MMP-3降解细胞外基质的胶原量减少,粘连加重,此时MMP-3/ TIMP-1≈1:1.72,肠粘连较术后2天组加重。

    术后14天组,随着组织愈合的继续,转化生长因子-β继续起主要作用,组织中MMP-3含量继续降低,此时,不再需要更多的TIMP-1抑制MMP-3的表达,TIMP-1的含量下降,与术后7天组相比,MMP-3和TIMP-1的含量差异有显著性(P值分别小于0.01和0.05)。此时,MMP-3/ TIMP-1≈1:2,TIMP-1的含量是MMP-3含量的2倍,使MMP-3的作用趋于静止,不能降解细胞外基质的胶原,形成稳定粘连。同样,术后14天组和术后2天组相比差异有显著性(P值均小于0.01)。说明两组间肠粘连的程度不同,根据两组间MMP-3含量及TIMP-1的含量的变化,能够得出术后14天组肠粘连程度较重的结论。

    因此,本研究提示,MMP-3、TIMP-1在手术后不同时期的不同表达可能在肠粘连的形成中发挥一定作用。在手术中和手术后初期进行临床干预是预防肠粘连的最佳时期, MMPs和TIMPs的活性表达是一个部分影响腹膜组织修复和粘连形成的因素,有可能为预防术后肠粘连的形成提供新的靶点。

 

【参考文献】
  1 Bolcato Bellemin AL,Elkaim R,Abehsera A,et al.Expression of mRNAs encoding for alpha and beta integrin subunits,MMPs,and TIMPs in stretched human periodontal ligament and gingival fibroblasts.J Dent Res,2000,79(9):1712-1716.

2 尚晓滨,吴咸中,李东华,等.活血化瘀中药对清解通下中药增效作用的实验研究Ⅴ-对粘连组织中MMP-1和TIMP-1影响的实验研究.中国中西医结合外科杂志,2006,12(4):385-388.

3 Arumugam S,Jang YC,Chen Jensen C,et al.Temporal activity of plasminogen activity of plasminogen activators and martrix metalloproteinases during cutaneous wound repair.Surgery,1999,125(6):587-593.

4 文亮,屈纪富,刘明华.基质金属蛋白酶3在创伤愈合中作用的实验研究.世界急危重病医学杂志,2007,4(2):1751-1754.

5 汤田凤,梁清华.痹肿消汤对活动期类风湿关节炎患者血清基质金属蛋白酶3及其组织抑制剂1的影响.中国临床康复,2005,9(15):114-116.

6 刘智敏.基质金属蛋白酶的结构、功能和调节.生物医学工程杂志,2002,19:680-683.

7 Matrisian L.L Metalloproteinases and their inhibitors in matrix remodeling.Trends Genet,1990,6:121-125.

8 Ma C, Tarnuzzer RW, Chegini N. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases in mesothelial cells and their regulation by transforming growth factor-beta1. Wound Repair Regen,1999,7(6):477-485.

9 Klimiuk RA,Sierakowski S,Domyslawska I,et al.Effect of repeated infliximab therapy on serum matrix metalloproteinases and tissue inhibiters of metalloproteinasea in patients with rheumatoid arthritis .J Rheumatol,2004,31(2):238-242.

10 曾健,李小辉.腹膜粘连的分子机制及药物防治.世界华人消化杂志,2003,11(9):1429-1432.


作者单位:266101 山东青岛,青岛市崂山区妇幼保健院(Δ青岛大学医学院在读研究生)

作者: 林宏,李 娜,郭新华 2008-6-30
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