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【摘要】 肥胖是一种体内脂肪堆积过多和（或）分布不均匀，体重增加，是遗传因素和环境因素共同作用的结果,同时它也是一种代谢异常性的疾病。单纯性肥胖者多有家族史。因饮食因素,热量摄入过多,尤其高脂肪或高糖饮食均导致脂肪堆积而形成营养性肥胖。西布曲明为作用于中枢的肥胖症治疗药，主要通过其胺类（仲胺和伯胺类）代谢产物而产生作用，其主要机制为抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再摄取而增强饱食感，从而减少能量摄入。PPARγ在脂肪细胞分化、糖代谢以及其他生理过程中起到重要的作用，在白色和棕色脂肪组织中均有高表达。文献报道，PPARγ基因敲除的大鼠表现出棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）形成和功能的异常，而且这些大鼠表现出血清中瘦素（LEPTIN）和胰岛素（INSULIN）水平的增高，即PPARγ的水平高低与瘦素和胰岛素的水平呈负相关。本研究旨在通过对人工复制的营养性肥胖大鼠模型的作用来研究该药的作用机制与PPARγ的相关性，以及从形态学和组织学角度观察不同剂量的对大鼠减重效果的影响。
【关键词】 营养性肥胖 曲布西明 PPARγ 动物模型
Influence of Sibutramine on the expression of PPARγ in adipose cells of alimentary obesity rats
ZHAO Wen-yan, ZHAO Jian-zhu, WANG Qian.Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang 110004,China
【Abstract】 Generally obesity is the abnormal state of having too much fat in the human body, and it is a kind of chronic metabotical disease caused by various factorts. Sibutramine mainly make effect by two metabolic products M1 and M2, which lead to the feeling of disliking dining and it can activate β3-E receptor in BAT by stimulating the sympathetic nerves. Sibutramine contributes well in reducing body weight.Peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ) is a significant factor in the differentiation of adipose cells, glycometabolism and many other physiological process. The level of PPARγ in BAT and WAT are relatively high. Documents said that in the rats whose PPARγ gene were knocked, the level of leptin and insulin in their serum increased obviously, without restraining of sugar. That is, the level of PPARγ is inappropriated with the level of leptin and insulin.
【Key words】 alimentary obesity; Sibutramine; PPARγ; animal model
通过西布曲明对人工复制的营养性肥胖大鼠模型的作用来研究该药的作用机制与PPARγ的相关性，以及从形态学和组织学角度观察不同剂量的西布曲明对大鼠减重效果的影响。
1 实验原理
盐酸西布曲明一水合物是以外消旋体的形式存在。其主要作用机制为：抑制神经细胞对5-羟色胺、去甲肾上腺素的再摄取；可以下调β-肾上腺素受体结合能力及去甲肾上腺素受体刺激腺苷酸环化酶系统。其药理活性并非通过促进5-HT释放而起作用，这一点不同于右芬氟拉明（右氟苯丙胺，dexfenfluramine）和右安非他明（右苯丙胺，dexamfetamine），前者主要通过促进释放5-HT 起作用，而 后者则主要是通过促进释放多巴胺及去甲肾上腺素起作用的。体外研究以及动物和人体的实验都显示西布曲明对多巴胺的释放无明显影响。盐酸西布曲明一水合物可以通过增加饱满感而减少进食量；同 时通过诱导产热作用而增加能量消耗。药物和活性代谢产物明显剂量依赖性地引起肥胖大鼠的进食减少。这种作用可能是中枢诱导的，主要通过抑制5-HT和去甲肾上腺素的再摄取引起5-HT 2A/2C和β受体活性增加，从而产生一种厌食感。盐酸西布曲明阻止大脑中的神经递质5-HT和去甲肾上腺素再摄取，使它们在神经细胞中维持较高浓度，增加过饱感。除此之外，有迹象表明它可增加代谢，消耗热量，最终产生降低体重的功能。同时文献报道，盐酸西布曲明对血清中瘦素和胰岛素水平的下调有一定影响［1，2］。
PPARγ在脂肪细胞分化、糖代谢以及其他生理过程中起到重要的作用，在白色和棕色脂肪组织中均有高表达。文献报道，PPARγ基因敲除的大鼠表现出棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）形成和功能的异常，而且这些大鼠表现出血清中瘦素（LEPTIN）和胰岛素（INSULIN）水平的增高，表现出对糖类物质耐受，不表现出胰岛素的抑制。即：PPARγ的水平高低与瘦素和胰岛素的水平呈负相关［2］。
由此推测西布曲明有可能是一定程度上通过PPARγ的作用产生减肥效果。
通过组织学方法可以测定用药前后脂肪细胞数目及形态学变化，从而评价西布曲明的减肥作用以及浓度影响的差异；免疫组化实验和蛋白印记（Western-Blotting）实验可以半定量的测出脂肪细胞中PPARγ表达的变化。
2 材料与方法
2.1 实验药品 盐酸西布曲明,生理盐水, PPARγ抗体（SANTA GRUZ公司）。
2.2 实验对象 幼年Wistar大白鼠70只进行营养性肥胖动物模型的复制。
2.3 实验方法
2.3.1 复制营养性肥胖大鼠的动物模型［3］
2.3.1.1 实验动物 将100只Wistar大鼠，用以下高脂饲料饲养16周。
2.3.1.2 饲料 见表1。普通饲料：实验鼠全价饲料；高脂饲料：普通饲料60%，猪油 12%，蔗糖5%，花生5%，鸡蛋10%，麻油1%，食盐2%［4］。
2.3.1.3 造模方法 所有大鼠再造模期间自由摄食和饮水，饲料和水每日更换1次。饲养环境清洁，明暗同期为12h，温度，湿度适宜，通风良好。
2.3.1.4 观察指标 造模期间定时观察大鼠摄食量，饮水量，尿量，粪便质地和量，体重（W），体长（H），Lees指数。
2.3.1.5 大鼠肥胖判断标准 根据观察指标计算Lees指数（肥胖评定指数），凡经高脂饲料喂养16周后，大鼠的体重超过原体重20%的作为实验性肥胖大鼠。表1 饲料配方和主要营养成分（g/100g饲料）
2.3.2 分组 造型后符合标准的动物50只，随机分为5组，每组10只。第一组作为模型组，复制成功后杀掉,按观察指标实验；第二组作为实验对照组，正常培养15天,每天灌喂2ml生理盐水；第三组每天灌喂1.5mg/ml浓度的盐酸西布曲明溶液2ml连续15天；第四组每天灌喂3.0mg/ml浓度的盐酸西布曲明连续2ml连续15天；第五组每天灌喂6.0mg/ml浓度的盐酸西布曲明连续2ml连续15天。
2.3.3 观察指标 再次称量每只大鼠重量，比照用药前计算体重改变率。将动物断头法处死后取其腹部的白色脂肪组织以及肩胛部位的棕色脂肪组织，置于-70℃冰箱中备用。
2.3.3.1 组织学测定 (1)取各组大鼠白色脂肪组织和棕色脂肪组织少许，制成冰冻切片；(2)苏丹Ⅲ染色,在显微镜(×400)下人工计数脂肪细胞数目；(3)在显微镜(×400)下测量脂肪细胞直径,计算脂肪细胞体积。
2.3.3.2 免疫组化实验 实验步骤：(1)制作脂肪组织冰冻切片(厚度10μm)；(2)多聚甲醛再固定；(3)水洗；(4)用H2O2消除内源性过氧化物酶活性,PBS洗；(5)非免疫血清封闭；(6)PPARγ一抗4℃；(7)PBS洗5min×3,加二抗,室温20min；(8)PBS洗5min×3, SP室温20min；(9)AEC显色；(10)水性封片剂封片。
结果判定：(1)显微镜(×400)下,选定视野,测定PPARγ阳性细胞比率；(2)显微镜(×400)下对PPARγ阳性细胞进行灰度测定；(3)测定结果采用t检验进行分析。
2.3.3.3 Western-Blotting实验 实验步骤：(1)脂肪组织匀浆制备,蛋白定量；(2)用电泳法分离蛋白；(3)转膜(转移到PVDF膜上)；(4)PVDF膜封闭(使用脱脂奶粉减少非特异性染色)；(5)加PPARγ 一抗孵育,室温2h；(6)加HRP标记的二抗孵育,室温2h；(7)ECL显色。
结果判定：采用图像分析系统进行结果分析［5］。
3 实验结果
对照模型组和实验对照组,发现灌喂西布曲明后的大鼠减重明显,且不同的药物剂量的减肥效果存在差异。
3.1 组织学测定 染色后在400倍显微镜下观察,计算脂肪细胞数目,测量脂肪细胞直径,计算细胞体积,对照实验对照组发现用药后脂肪细胞数目减少(也有可能不发生大的变化),脂肪细胞体积减小,而且用药的剂量与脂肪细胞的数目和体积呈正相关。
3.2 免疫组化实验 在400倍显微镜下测定着色细胞(PPARγ阳性)的比率,对照实验对照组,发现用药后脂肪细胞PPARγ表达增强,阳性比率增大,且与用药浓度呈正相关。
灰度测定:发现用药后脂肪细胞中PPARγ表达增多,从而灰度增大,而且改变程度与给药浓度呈正相关。
3.3 Western-Blotting实验 通过图像分析系统看出用药后脂肪细胞PPARγ的表达增强，且药物浓度与其呈正相关。
4 讨论与结论
作为一种可持续终生的疾病，肥胖需要长期治疗。当过于肥胖而经节食、体育运动等手段不能控制体重时，就需要药物治疗。药物治疗途径通常为控制食欲，促进饱胀感，改变营养分配和产热运动。盐酸西布曲明作为一种口服有效制剂，主要通过产生饱胀感，从而减少能量的摄入，并通过产热作用增加能量消耗。本实验通过研究营养性肥胖大鼠模型的复制，以及大鼠减肥的效果，再通过免疫组织化学实验以及蛋白印迹实验研究大鼠脂肪细胞中PPARγ表达的变化。基本得出结论：西布曲明是通过脂肪细胞中PPARγ表达得增强而影响血清中瘦素和胰岛素的浓度水平，调节体重的下降。
【参考文献】
1 Wahli W,Braissant O,Desvergne B.Safety pharmacology of sibutramine mesylate, an anti-obesity drug.Chem Biol,1995，2（5）：261-266.
2 Wendy M,Goa Karen L.Sibutramine a review of its contribution to the management of obesity.Drugs,1998,56(6):1093-1124.
3 孙志，张中成，刘志诚 .营养性肥胖动物的实验研究.中国药理学通报,2002,18（4）:466-467.
4 刘利民,叶恭绍,叶广俊.高脂饲料致大鼠肥胖的实验研究.北京医科大学学报,1991,23(5):359-361.
5 杜宏,赵明,王坚.影响肥胖患者血清瘦素水平的相关因素分析.江苏医药杂志，2001，27（9）：6-7.
作者单位：110004 辽宁沈阳，中国医科大学附属盛京医院学生科