点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨MDM2基因mRNA的表达与儿童急性白血病（AL）的关系。方法 采用逆转录多聚酶链式反应技术（RT-PCR），对42例初发或复发AL患儿和13例完全缓解AL(AL-CR)患儿及15例非恶性疾病患儿骨髓单个核细胞进行MDM2 mRNA表达的检测。结果 AL组中MDM2 mRNA的表达率为57.1%，明显高于AL-CR组和对照组；完全缓解组和对照组差异无显著性。MDM2 mRNA的表达与白细胞总数及临床危险度分型有关，与性别、年龄、免疫分型无明显相关性。MDM2 mRNA表达者缓解率低。结论 儿童AL中存在MDM2 mRNA过表达，且可能与儿童AL发病有关；MDM2 mRNA表达是AL的不良预后因素；AL MDM2 mRNA表达者可以降低AL的化疗敏感性，MDM2 mRNA表达对AL有疗效判断和预后的价值。
【关键词】 急性白血病；儿童； MDM2； 逆转录多聚酶链式反应
Expression of MDM2 gene in childhood acute leukemia
LIU Zhuang, TAN Li-zhen, WU Xiang-qin, et al.Department of Pediatrics, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of MDM2 gene in childhood acute leukemia (AL). Methods The mRNA expression of MDM2 gene was examined by RT-PCR in bone marrow cells from 42 cases of incipient or relapsed childhood AL, 13 cases of complete remission AL (AL-CR) and 15 children without malignance disease as control group.Results 57.1% AL cases were positive for MDM2 mRNA, remarkably significant higher than that of control group and AL-CR group. There was no difference of MDM2 mRNA expression between AL-CR group and control group. The expression of MDM2 mRNA was connected with initial white blood cell (WBC) count and clinical risk type of AL. There was no connection between MDM2 mRNA expression and some clinical and laboratory parameters such as age, sex and immunogenic type. The remission rate in patients with high expression of MDM2 mRNA was lower. Conclusion There is over expression of MDM2 mRNA in childhood acute leukemia, which may be related to pathogenesis of AL. The expression of MDM2 may imply higher risk and lower sensitivity of the leukemic cells to chemotherapy. The expression of MDM2 mRNA might be the index of treatment effect and poor prognosis.
【Key words】 acute leukemia; child; MDM2; reverse transcription-polymerase chain reaction
MDM2(murine double minute 2)基因是从自然转化的Bal B/C小鼠细胞株中发现的癌基因，它编码一种DNA结合蛋白，该蛋白与p53蛋白形成复合体，致p53失去对肿瘤活性的抑制作用，从而导致肿瘤的发生和发展，造成肿瘤对放疗、化疗的耐受，与不良预后有关［1,2］ 。为探讨儿童急性白血病的MDM2过度表达的发生率及其与疾病的发生发展的关系，笔者采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法对儿童急性白血病（AL）患者骨髓单个核细胞MDM2 mRNA的表达进行了检测，现报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象 病例组：初发及复发未治AL组42例，为2004年2月～2006年11月期间在广西医科大学第一附属医院儿科住院的AL初发及复发且未经治疗患儿，均经骨髓细胞学检查确诊。其中ALL 32例（其中Ｌ1 3例、Ｌ2 27例、L3 2例），ANLL 10例（M2a 4例、M2b 1例、M3a 3例、M3b 1例、M4b 1例）。男27例，女15例；年龄2～14岁，中位年龄8岁。初发组35例，复发组7例。初发组中ALL 26例，其中B-ALL 16例，T-ALL 5例，5例未进行免疫分型，ANLL 9例。初发组中高危8例，标危27例。诊断及分型依据文献［3］，各组性别、年龄等条件相似。缓解组（AL-CR组）13例，为同期住院的AL治疗后达完全缓解（CR）患儿，其中男9例，女4例;年龄3.8～14岁，中位年龄8.6岁。均经骨髓细胞学检查证实为AL-CR。 对照组15例，为同期住院的非恶性血液病（特发性血小板减少性紫癜、缺铁性贫血等）,男９例，女6例;年龄3～14岁，中位年龄8.9岁。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 骨髓涂片后,抽取骨髓液1～2 ml，ACD抗凝，采用Ficoll密度梯度离心分离出单个核细胞(MNC)，PBS洗涤2次，-80℃保存。
1.2.2 总RNA提取 按照Trizol试剂盒（Gibco BRL Invitrogen，USA）说明提取总RNA。用紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280>1.8)，同时进行RNA定量，并经甲醛琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整。-80℃保存备用。
1.2.3 cDNA逆转录反应 20.0μl反应体系, 总RNA 2μl(1μg/μl), oligo(dT)18 1.0μl引物1.0μｌ,去离子水9.0μl,混匀。70℃ 5min,冰浴冷却,离心混匀,加下列反应物:5×缓冲液4.0μl, dNTPs (10mmol/Ｌ)2.0μl, RNasin 1.0μl,混匀,37℃ 5min,然后加入M-MuLV逆转录酶 (200u/μl)1.0μl，42℃ 60min,70℃ 10min,冰浴冷却终止反应。-20℃保存待用。
1.2.4 MDM2 cDNA的PCR反应 引物设计参考文献［4］,由上海生工公司合成。MDM2有意义链引物:5′-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3′,反意义链引物:5′-TGAAGGTTTCTCTTCCTGAAG-3′,扩增产物长度336bp。内对照β-actin上游引物5′-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3′,β-actin下游引物5′-TACATG GCTGGGGTGTTGAA-3′,扩增产物长度218bp。反应体系40.0μl,取cDNA产物10.0μl,加dNTPs、缓冲液、MgCl2、MDM2与β-actin引物、去离子水。终浓度为：dNTPs 0.2mol/Ｌ,MgCl2 2.5mol/Ｌ,各引物浓度均为25pmol/L。94℃预反应4min,加Taq酶2.0u，进行32个PCR循环,每循环94℃ 45ｓ、54℃ 40ｓ、74℃ 40ｓ,终末延伸72℃5min。
1.2.5 PCR产物分析 2.0%琼脂糖凝胶电泳80min,在紫外光下观察,用BIO RAD公司的凝胶图像分析软件进行吸光度(Ａ值)分析,计算MDM2 /β-actin值,以此得到MDM2基因表达水平。参照文献［4］的评定标准,以MDM2 /β-actin的比值>16%为MDM2 mRNA过表达。
1.3 统计学处理 使用SPSS10.0软件包对实验结果进行统计学处理，对数据进行卡方检验、Fisher精确概率法。
2 结果
2.1 病例组和对照组MDM2 ｍRNA的表达 见表1。42例AL中有24例MDM2表达，表达率为57.1%，13例AL-CR及15例对照组中无MDM2 mRNA表达，MDM2 mRNA表达率在AL组与对照组、AL组与AL-CR组之间均差异有显著性（P=0.0002，P=0.0001）；AL-CR组和对照组比较差异无显著性（P=1.000）。表1 MDM2 mRNA在病例组和对照组的表达
2.2 AL初发组与复发组MDM2 mRNA的表达比较 35例AL初发组中MDM2 mRNA过度表达19例，表达率为54.3%，7例AL复发组中MDM2 mRNA表达5例，表达率为71.4%，两者之间差异无显著性（P=0.675）。
2.3 MDM2 mRNA表达与化疗反应的关系 见表2。AL组中有19例患者完成了诱导缓解化疗，其中初发AL 13例、复发AL 6例。初发13例中诱导化疗后达完全缓解（CR）10例，未缓解（NR）3例，6例复发病例中，CR 2例，NR 4例。CR与NR病例的MDM2 mRNA表达水平无论是治疗前还是治疗后均差异有显著性，NR患者表达水平显著高于CR患者（P均<0.05）。CR病例缓解后与自身缓解前的MDM2 mRNA表达差异有显著性（P<0.05）。未缓解病例治疗前后MDM2 mRNA表达差异无显著性（P>0.05）。表2 儿童AL MDM2 mRNA表达与化疗反应的关系注：采用秩和检验，NR与CR组比较，▲P<0.05；与治疗前比较，●P<0.05，★P>0.05。CR：完全缓解；NR：未缓解
2.4 AL初发组MDM2 mRNA表达水平与临床特征及临床分型的关系 见表3。WBC≥100×109/L患儿与WBC<100×109/Ｌ患儿之间、高危型患儿与标危型患儿之间均差异有显著性。在年龄≥10岁或<1岁与1～10岁患儿之间、男性与女性之间、T-ALL和B-ALL之间均差异无显著性。表3 MDM2 mRNA表达水平与儿童AL临床特征及临床分型的关系
3 讨论
MDM2属癌基因，具有调节细胞生长的作用，可通过与启动细胞周期的启动子直接联结，使细胞从G1期向S期转化，促进细胞增殖，MDM2转录产物MDM2蛋白还可与抑癌基因p53产物p53蛋白结合,抑制p53介导的转录活性,并将p53蛋白转运到细胞质中降解，从而抑制细胞凋亡［5,6］。许多肿瘤中有MDM2过度表达，MDM2基因过度表达时会促使肿瘤的发生发展，并且MDM2过度表达者肿瘤恶性度高，还会造成肿瘤对放疗、化疗的耐受，与不良预后有关［1,2］。
在造血系统恶性疾病中,可有不同程度的MDM２基因扩增及mRNA的过度表达, 并且与不良预后有关。笔者曾对31例儿童非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者MDM2 mRNA的表达状况进行了检测，发现MDM2的表达与儿童NHL的不良状况、不良预后有关［7］。樊娟等［8］采用免疫组化法观察AML患者MDM2蛋白表达情况,有75%的AML患者有不同程度的MDM2蛋白的过度表达,且发现AML各亚型中均有MDM2蛋白阳性表达的患者,提示MDM2基因的过度表达在白血病的发病中起一定的作用。蒋莎义等［9］检测儿童急性淋巴细胞性白血病, 其结果显示MDM2 mRNA表达率为 44%,不良预后患者中过表达率达到83%。本组资料中笔者采用RT-CR方法检测了42例儿童急性白血病(AL)患者的MDM2 mRNA表达状况，发现儿童AL中MDM2 mRNA表达率为57.1%，明显高于AL-CR及对照组；在高危组表达率达87.5%，明显高于标危组，而在WBC计数≥100×109/L的6例患者表达率更达100%；在完成诱导化疗的19例AL中，完全缓解与未缓解病例的MDM2 mRNA表达水平无论是治疗前还是治疗后均差异有显著性，未缓解患者表达水平显著高于完全缓解患者。提示MDM2 mRNA表达状况与儿童AL的发病、疗效、预后有一定关系, MDM２ mRNA表达的检测有助于对儿童AL细胞对化疗的敏感性及其预后的评估。
【参考文献】
1 Juven-Gershon T, Oren M. MDM2: the ups and downs. Mol Med, 1999, 5(2):71-83.
2 Momand J, Wu HH, Dasgupta G. MDM2-master regulator of the tumor suppresser protein. Gene, 2000,242(1-2):15-29.
3 黄绍良. 小儿血液病临床手册,第2版.北京:人民卫生出版社,2000,484-547.
4 Bueso-Ramos CE, Yang YY, Deleon E, et al. The human MDM-2 oncogene is overexpressed in leukemias. Blood, 1993, 82(9):2617-2623.
5 Haupt Y, Maya R, Kazaz A, et al. MDM2 promotes the rapid degradation of p53. Nature, 1997, 387(6630):296-299.
6 Prives C. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit. Cell, 1998, 95(1):5-8.
7 刘壮，龙桂芳，韩蕴丽，等. MDM2的表达与儿童非霍奇金淋巴瘤关系的研究. 中华儿科杂志, 2004, 42(12):928-931.
8 樊娟, 徐功立, 徐键,等. MDM2和p53基因在急性白血病细胞中的表达及意义. 癌症, 2000, 19(8):786-788.
9 蒋莎义, 陈力军, 高飞, 等. 癌基因MDM2过度表达与儿童急性淋巴白血病的发病和预后的关系. 中华儿科杂志, 2000, 38:445.
作者单位：广西南宁，广西医科大学第一附属医院儿科 广西柳州，柳州中医院肿瘤科