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【摘要】 目的 探讨扶正软坚方对博莱霉素致大鼠肺纤维化的影响及其作用机制。方法 Wistar雄性大鼠60只，随机分为空白组、模型组、扶正软坚方大剂量组、扶正软坚方小剂量组。博莱霉毒诱发大鼠肺纤维化建立模型，第28天时测定支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞和血清中白介素-8的水平;应用免疫荧光方法，激光共聚焦显微镜检测肺组织转化生长因子-β1的表达，并进行定量分析。结果 与空白组比较，模型组IL-8含量和TGF-β1表达明显增强(P<0.01);与模型组比较，扶正软坚方各组能明显降低IL-8含量和TGF-β1的表达(P<0.01)。结论 应用扶正软坚方，可抑制IL-8和TGF-β1的产生，从而预防和减轻大鼠肺纤维化的形成。
【关键词】 扶正软坚方 肺纤维化 白介素-8 转化生长因子-β1
The effect of fuzhengruanjian prescriptions on interleukin-8 and transforming growth factor-β1 expression in lung tissue of pulmonary fibrosis rat models
LIU Heng,JI Xu-ming,ZHAO Qi-tao,et al.Shandong University of Tradition Chinese Medicine. Jinan 250355,China
【Abstract】 Objective To study the effect of Fuzhengruanjian prescriptions on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats and its possible mechanism.Methods Sixty male wistar rats were randomly divided into four groups: normal group,model group,large-dose group,little-dose group.The rat model was induced by bleomycin.The concentration of interleukin-8(IL-8) and the neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were detected,and the expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1 ) were detected by immunofluorescence technique andlaser scanning confocal microscope on 28th day after the treatment.Results The expressions of TGF-β1 and the concentration of IL-8 in the model group were significantly higher than those in the normal group(P<0.01),and Fuzhengruanjian prescriptions could significantly decrease the expressions of TGF-β1 and the concentration of IL-8 compared with those of model group(P<0.01).Conclusion Early intervention with Fuzhengruanjian prescriptions could inhibit the expression of TGF-β1 and the content of IL-8,and prevent the development of alveolitis and fibrosis of lungs in bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats.
【Key words】 Fuzhengruanjian prescriptions;pulmonary fibrosis;interleukin-8; transforming growth factor-β1
肺纤维化是多种病因引起的一种慢性炎症性间质性肺疾病，以肺间质性弥漫性炎性渗出、浸润和纤维化为主要病变。目前认为，肺纤维化的发病最初就有成纤维灶的形成[1]。且血管的生成在肺纤维化发生早期可能起重要作用，调节过度的血管生成有可能延缓肺纤维化的发展进程[2]。本研究通过动物实验探讨扶正软坚方对博莱霉素致大鼠肺纤维化的影响并进行机制分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar健康雄性大鼠60只,体重180～200g，购于山东中医药大学实验动物中心，正常饲养1周开始实验。
1.2 主要药物及试剂 博莱霉素为日本化药株式会社生产，批号：540100。扶正软坚方由黄芪、麦冬、炒白术、昆布、当归、黄芩、甘草组成，制备工艺为按处方比例称取中药材，加11倍量水，煎煮2次，每次2.5h，水煎液过滤，浓缩，加乙醇，调含醇量至50%，过滤，滤液回收乙醇，各用。小鼠抗大鼠转化生长因子-β1单克隆抗体 (TGF-β1)，羊抗小鼠FITC-IgG均购自北京中彬生物技术有限公司。
1.3 肺纤维化模型制备 参照文献方法用博莱霉素制备大鼠肺纤维化模型[3]。腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)麻醉大鼠，仰卧固定，常规消毒，颈正中切开皮肤，钝性分离气管，于气管软骨环间隙用1ml注射器缓慢注入博莱霉素(5mg/kg)0.2～0.3ml,立即将大鼠直立旋转，使肺内药物分布均匀，空白组以同样方法气管内注入等量生理盐水。
1.4 分组及用药 分为空白组、模型组、扶正软坚方大剂量组(简称大剂量组)、扶正软坚方小剂量组(简称小剂量组)4个组别，每组15只动物。在造模后的第2天开始用药，大剂量组按照24g/(kg·d)，小剂量组按照12g/(kg·d)，空白组、模型组灌服生理盐水，各组稀释等量灌胃，每天1次，给药至实验第28天。每周复查动物体重调整给药量。
1.5 指标测定
1.5.1 肺泡灌洗液中中性粒细胞计数 大鼠固定并暴露气管，做T字形切口，注入生理盐水4ml，快速回吸，将肺泡灌洗液离心沉淀，涂片染色进行细胞计数。
1.5.2 血清中IL-8检测 实验动物下腔静脉取血，离心取血清，放射免疫法检测IL-8的含量。
1.5.3 TGF-β1检测 免疫荧光+激光共聚焦显微镜检测TGF-β1表达。石蜡切片脱蜡，正常血清封闭，一抗4℃过夜，0.1M PBS (pH7.4) 冲洗，二抗37℃孵育20min，0.1M PBS (pH7.4) 冲洗，Zeiss LSM510激光共聚焦显微镜检测。Zeiss LSM510 Image Examiner图像分析软件半定量分析图像相对荧光强度，蛋白表达量以相对荧光强度表示。
1.6 统计学处理 数据用x±s表示，统计软件SPSS10.5处理，采用t检验。
2 结果
2.1 扶正软坚方对肺纤维化大鼠BALF中中性粒细胞计数及IL-8含量的影响 见表1。 表1 扶正软坚方对BALF中中性粒细胞计数及IL-8含量的影响 注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.05;与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.05
2.2 扶正软坚方对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1表达的影响 与空白组比较，模型组TGF-β1表达明显增强(P<0.01), 差异有显著性;与模型组比较，扶正软坚方各组能明显降低TGF-β1的表达(P<0.01),差异有显著性。见表2。表1 扶正软坚方对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1表达的影响 注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.05;与模型组比较，△P<0.05
3 讨论
新的观点认为，在肺纤维化的发病最初就有成纤维细胞灶的形成，伴或不伴间质性炎症，最终形成肺纤维化[4]，血管生成与肺纤维化的发生有一定的关系。因此，目前对肺纤维化治疗方法的研究更强调早期抗纤维化，且调节过度的血管生成，可以延缓肺纤维化的发展过程[2]。
IL-8是一种炎症细胞因子，参与局部损伤和炎症反应，为中性粒细胞趋化因子，通过炎症反应使成纤维细胞增殖和肺部结构改变。研究表明，IL-8具有血管内皮细胞趋化性，在肺损伤后能检测到IL-8的升高，且肺纤维化大鼠给予干扰素诱导蛋白10(IP-10)可明显减轻纤维化程度[5]。肺纤维化大鼠中药复方干预治疗后，能明显降低IL-8的表达，同时减轻肺纤维化程度[6]。TGF-β1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂，早期通过趋化炎症细胞参与肺损伤和炎症反应，而后主要是促进细胞外基质形成和抵制其酶解作用，促进纤维蛋白原向肌成纤维细胞转化，同时影响其他纤维化细胞因子，导致纤维化发生[7]。研究认为，TGF-β1还是一种促血管生成因子，可能通过调节内皮细胞的成活[8]及VEGF的表达而促进新生血管的发生[9]，最终导致纤维化。
在中医传统著述中，没有与肺间质纤维化完全相对应的病名。根据本病的临床表现，一般将其列入“咳嗽”、“肺胀”或“短气”等门中。认为其病机属本虚标实，肺脾气(阴)亏虚为本，痰浊、瘀血、热毒为标，治当益气活血，化痰散结，并以之立法处方组成扶正软坚方，方中黄芪补益肺气，白术健脾益气，当归活血化瘀，昆布化痰散结，黄芩清肺热，麦冬滋肺阴。且现代临床研究以上单味制剂或配于复方中对肺间质纤维化有试验性或临床性治疗作用[10]。本实验发现，模型组病理出现炎细胞浸润与纤维聚集，BALF中中性粒细胞增多 ，IL-8含量增多， TGF-β1表达较正常组增设，经扶正软坚方干预治疗后，以上指标明显减低。由以上结果推测，扶正软坚方抗肺纤维化的机制可能是:(1)抑制炎细胞的渗出与趋化，减少细胞因子的产生和释放;(2)通过抑制TGF-β1表达而抑制肺成纤维细胞的增殖，减少胶原合成与分泌，而达到拮抗肺纤维化的目的;(3)可能与调节血管生成有关，但具体作用机制有待进一步研究。因此，扶正软坚方是防治肺纤维化的理想中药复方。
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作者单位：250355 山东济南,山东中医药大学