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【摘要】 目的 从采自不同来源的临床标本分离凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)，测定其胞外多糖蛋白复合物(glycocalyx)，并以胞外多糖产生作为毒力指标确定CNS的致病性。方法 用刚果红粘附试验检测CNS的胞外多糖，并用刚果红-阿里新蓝染液对胞外多糖进行联合染色，以采自皮肤的CNS样本作阴性对照。 结果 在刚果红琼脂培养基中致病性CNS菌落呈黑色，阴性对照组CNS菌落为红色。镜下观察，在淡蓝色背景下致病性CNS菌体着色较深，菌体表面的蛋白复合物为深红色，阴性对照组菌体着色较浅，菌体表面无蛋白复合物而显淡红色。结论 致病性CNS菌的分离及其细菌胞外多糖蛋白复合物的检测并以此作毒力指标，为临床判定致病性CNS感染能提供可靠的实验依据。
【关键词】 凝固酶阴性葡萄球菌;多糖蛋白复合物; 刚果红培养基;刚果红-阿里新蓝染液
Nosocomial infection of coagulase-negative staphylococci and detective significance of its extracellular glycocalyx
CUI Xian-nian，HUANG Li-ya，SUN Jie-sheng,et al.The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture,Enshi 445000, China
【Abstract】 Objective To isolate and identify coagulase-negative staphylococci (CNS) from different sites of clinical patients and evaluate clinical pathogenesis of extracellular glycocalyx of CNS as a potential indicator of virulence. Methods Isolates were obtained from clinical samples of blood, urine, sputum，semen, secretions and cerebrospinal fluid, then to detect extracellular glycocalyx of CNS with congo red adhesion experiment and stain with Congo red and Alcian blue together, and to compare with isolates from skins of healthy controls. Results A positive result of pathogenic CNS on congo red agar(CRA) was indicated by black colonies and a negative control usually remained pink ones, with observation under light blue background by light microscope colonies of pathogenic CNS with production of glycocalyx stained by congo red and Alcian blue together grow upon deep red and ones of healthy control without glycocalyx present light red. Conclusion Isolation of pathogenic CNS and assessment of its virulence by CRA and congo red combining Alcian blue staining might offer theoretical basis and reliable experimental evidence for judging nosocomial infection of pathogenic CNS.
【Key words】 coagulase-negative staphylococci (CNS);glycocalyx;congo red agar(CRA);congo red and Alcian blue stains
凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci，CNS)属人体正常菌群，广泛存在于人体的皮肤和黏膜上，一般情况下不会导致疾病。但随着介入性治疗和免疫抑制剂的广泛使用，现已成为医院内感染的重要的条件致病菌。怎样快速、准确地检出CNS并预测其耐药性变化，对临床治疗及预防都有十分重要的意义[1～3]。本研究旨在通过刚果红粘附试验和刚果红-阿里新蓝联合染色[4]，对采自临床各科的各种标本进行CNS进行分离培养并做胞外多糖蛋白复合物的检测，以胞外多糖产生作毒力指标确定CNS的致病性，建立快速可靠的诊断治疗方法，为医院有效控制CNS感染提供实验基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验分组 本研究分临床组60株和对照组20株。
1.2 标本来源 临床组60株，采自恩施自治州中心医院各科不同年龄和性别住院患者的痰液、尿液、分泌物、精液、血液和脑脊液。对照组20株，采自恩施自治州卫生学校不同年龄和性别学生的手部、耳垂皮肤。两组标本均按规定要求采集。
1.3 细菌培养基及细菌染液配制
1.3.1 牛脑心浸液肉汤刚果红琼脂细菌培养基 刚果红水溶液(0.8g/L)，121℃高压灭菌15min。蔗糖(50g/L)、琼脂(10g/L )，加双蒸水1000ml，121℃高压灭菌15min，待温度缓慢降至55℃时，加入牛脑心浸液(37g/L)及刚果红水溶液(适量)，制成固体培养基。
1.3.2 染液配制 阿里新蓝(AB)染液：阿里新蓝2g，冰醋酸3ml，蒸馏水97ml。刚果红(CRA)染液：刚果红2g，蒸馏水100ml。
1.4 细菌分离、鉴定
1.4.1 刚果红琼脂粘附试验 将各标本分离出的CNS接种于培养基中，37℃条件下孵育24h，然后置室温中24h。
1.4.2 刚果红-阿利新蓝染色 滴生理盐水少许于洁净载玻片上，用接种针挑取粘附试验分离的细菌与之混匀后, 再滴加与生理盐水等量的AB染液, 混匀并静置3～5min, 烤箱50～60℃加热固定, 直到染液水分完全挥发, 然后再滴加少许刚果红染液, 均匀涂布, 用烤箱干燥,以蒸馏水冲洗至无染料流下为止,烤干水分，油镜观察。
2 结果
临床组分离出35个阳性菌株,总阳性率为58%，对照组全部为阴性菌株(见表1)。表1 80株CNS粘附试验结果
致病性CNS有胞外多糖蛋白复合物生成，在刚果红琼脂培养基中菌落呈黑色，且干燥，显晶体光泽，阴性对照组CNS菌落为红色。镜下观察在淡蓝色背景下，致病性CNS菌体着色较深，胞外多糖蛋白复合物呈现暗红色(见图1～2)，阴性对照组菌体颜色明显淡于阳性组而呈现淡红色(见图3～4)。
3 讨论
在CNS引起的感染中，胞外多糖蛋白复合物的作用通过动物模型和临床研究已得到确认[5]。Christensen等报道，60%有临床意义的血培养分离 CNS产生了胞外多糖。虽不能直接说明胞外多糖蛋白复合物产生和疾病发生的关系，但有显著的统计学意义[6]。对从一些临床分离CNS产生胞外多糖蛋白复合物的研究表明，胞外多糖蛋白复合物有助于CNS粘附生物大分子并与疗效差和易复发有关[4]。CNS的胞外多糖蛋白复合物，为介导外源物体表面粘附和延长感染病程的主要毒力因子，是评定CNS致病性的重要条件[7]。
CNS胞外多糖蛋白复合物检测可提示其致病意义，且可提示其耐药性变化。对明确感染诊断、制定有效治疗方案有十分重要的意义，但不能作为惟一的因素。 CNS有数十种之多，是否所有CNS与医院获得性感染都有关，同一菌种是否都存在粘附性，在机体中所表现的毒力是否有差异，目前还不完全清楚[3]。 对于这些问题，还需进一步研究CNS的基因标志物，只有建立起敏感、快速，精确性和可靠性更高的鉴定方法或技术，才能更有效地解决医院CNS获得性感染的治疗和控制问题。
在细菌培养过程中，CNS产生的胞外多糖蛋白复合物可能丢失，因此本研究将采自临床各科的CNS标本，用牛脑心浸液肉汤刚果红琼脂培养法获取粘附菌株和非粘附菌株，即直接向培养基加入刚果红，使菌落在形成过程中显色，且在细菌生长的最佳时期作涂片，再用刚果红-阿里新蓝染液进行联合染色，直接、客观地观察到CNS胞外多糖蛋白复合物的生成情况，避免了阳性结果偏低的可能性。这种方法操作简便，用途广泛，除能用于细菌胞外多糖粘附素的观察外，也将在临床微生物原位标本检验中有较广的应用价值。
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