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【关键词】 神经凝胶复合嗅鞘细胞移植 大鼠 脊髓横断伤 实验研究
脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后神经再生和肢体功能恢复一直困扰医学临床的一大难题。近年来，随着神经细胞生物学、分子生物学、神经电生理学、神经移植等技术和组织工程材料的飞速发展，人们对损伤后神经轴突再生及其调控有了深入的了解，但对脊髓完全性横断伤后神经再生和肢功能恢复并没有取得突破性进展。近年来逐渐兴起的神经凝胶(neurogel，NG)[1~4]为利用神经生物工程技术实现脊髓完全性横断伤后神经再生和肢体功能恢复带来了新的希望，其有效性、安全性和可行性等方面已经取得了明确结论，并已作为商品投放科研市场;同样对嗅鞘细胞(OECs)促进损伤后神经细胞存活和轴突再生也已得到充分证实[5~8]。本研究拟以NG为支架，使高度纯化的OECs在其表面粘附、生长，构建NG-OECs复合体移植修复大鼠脊髓横断损伤，以观察和分析其对神经元存活和神经轴突再生的作用和意义。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM-F12(DF12)培养基购自Hyclone公司，小牛血清(NCS)、胰蛋白酶购自Gibico公司，hoechst33342、多聚赖氨1093酸(PLL)购自Sigma公司，P75抗体、EnVision试剂盒购自Dako公司(单克隆抗人抗体)、NF-200、Synaptophysin(多克隆抗体)抗体及DAB显色试剂盒均购自博士德公司。成年雌性Wistar大鼠60只，重250～300g，由河北医科大学实验动物中心提供。
1.2 OECs的取材、分离
OECs的分离、培养、纯化和标记：取2.5个月龄雌性Wistar大鼠的嗅球神经层及颗粒层;以0.25%胰蛋白酶消化，终止消化后用含20%胎牛血清的DF12培养基吹打成单细胞悬液，接种于未涂胶的玻璃培养瓶，置5%CO2孵箱37℃培养12h后将培养上清连同未贴壁细胞转种于另一个未涂胶的玻璃培养瓶，再培养12h;调整细胞密度为1×106/ml，种植于经poly-L-Lysine处理的6孔板，培养7天，加入Ara-C(终浓度为10-5mol/L)作用48h，清洗后培养液中添加forskolin和BPE(终浓度分别为20μmol/L和20μg/ml)，继续培养10天左右，行S-100常规免疫组化染色以确定纯度。细胞移植前培养液中加入BrdU孵育48h(作用浓度5μmol/L)。
1.3 OECs免疫细胞化学染色及纯度鉴定
将获得的OECs分别在原代分离后第2、7、14天做P75免疫细胞化学染色。取出6孔板内盖玻片，放入40g/L多聚甲醛室温下固定40min，PBS冲洗3次，加入封闭血清，室温下作用20min，PBS冲洗后，按DAKO公司提供EnVision工作程序加入P75抗体(抗人单抗)及其他试剂。显微镜观察，每个标本随机选取3个视野计数阳性细胞并计算平均阳性百分率。
1.4 构建NG-OECs复合体
筛选合适的细胞密度，利用微注射技术将OECs顺柱形NG主孔方向注入，与NG支架共培养，并利用光镜及电镜观察细胞在支架中的形态特点及生物学特性。
1.5 脊髓神经元与NG-OECs复合体共培养
取胎龄E16的大鼠脊髓神经元微注射法沿主孔方向接种于无血清培养NG-OECs复合体中，另将其接种于无OECs的NG中作为对照组。分别于接种后1、3、5、7、14天观察神经元生长情况。以NF-160抗体为一抗，进行细胞免疫组化染色，观察脊髓神经元的存活情况。用免疫荧光、免疫电镜等方法检测OECs与脊髓神经元体外共培养时生长整合情况。
1.6 实验动物分组
实验拟用雌性Wistar大鼠60只，分为单纯损伤和NG-OECs复合体移植两组，每组30只。
1.7 大鼠脊髓横断性损伤模型
按40mg/kg剂量麻醉大鼠，麻醉后固定于立体定向仪上，以T10为中心，设计切口。在显微镜下，无菌操作切除T10全椎板及T9、T11部分椎板，显露脊髓，剪开硬膜，以特制探针横预置3-0丝线于待损伤脊髓腹侧硬膜内。以剃须刀片于预置线头侧0.5mm(T9水平)将脊髓横断，顺利由腹侧向背侧提出预置线，明胶海绵轻柔压迫止血。移植后缝合硬膜及切口。
1.8 NG-OECs移植
各组分别于损伤后即时采用显微外科技术将构建好的NG-OECs复合体移植于脊髓断端，标准化操作。OECs对照组使用显微注射法将OECs悬液10μl(107/ml)注入距伤部3mm脊髓两断端处，留针10min后缓慢拔针。
1.9 脊髓神经功能恢复情况的评价
行为学评分：2组均于移植后1、2、3、4、6周及8周进行行为学检查，采用双盲法进行大鼠后肢运动功能评分(BBB记分法)，21分为功能正常，0分为功能完全丧失。BBB评分观察时间为5min。
1.10 脊髓前角运动神经元结构重建情况评价
应用组织学染色、免疫组化等方法评价脊髓损伤的结构重建情况，利用神经电生理和BBB评分观察其功能恢复情况。(1)组织切片病理染色观察各组脊髓损伤区神经纤维与胶质瘢痕生成情况，应用HE、FB和Holzer等染色方法。(2)超薄切片电镜观察再生神经纤维生长与延伸情况、再生纤维与OECs整合及突触形成等超微结构。
1.11 NG-OECs复合体移植技术的安全性检测
(1)免疫组织化学(NGFR、GFAP、BrdU)和免疫荧光技术检测细胞增殖分化状态及迁移情况。(2)移植细胞成瘤性检测：利用移植后长时间(大于半年)存活的动物，观察移植细胞是否具有异型性。
1.12 统计学分析
根据每一实验步骤取得的结果数据形式，应用SPSS12.0统计软件。组间比较采用t检验，P≤0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 BBB运动功能评分
所有大鼠脊髓全横断后第1、2周的BBB评分均为0分;伤后3周实验组和对照组后肢运动功能有轻微恢复;细胞移植4周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分明显高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。6周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分提高更为显著，且两组BBB评分差值有增大趋势，提示NG-OECs复合体移植可能对SCI大鼠后肢运动功能恢复有促进作用(表1)。
2.2 组织学观察
术后3周脊髓损伤区苏木精-伊红染色显示NG-OECs复合体移植组脊髓损伤区结构紊乱，纤维走行方向扭曲、不一致，细胞数目较多，嗜银染色结果显示无论在损伤区还是损伤头、尾端，NG-OECs复合体移植组神经纤维数量多于对照组。NG-OECs复合体移植组损伤头端神经纤维数量多于损伤尾端，对照组损伤头、尾端神经纤维数量基本一致。利用图像分析系统对嗅鞘细胞移植组、对照组脊髓损伤区和对照组相同节段CST区域嗜银染色进行神经纤维计数，其结果见表1。表1 NG-OECs组和对照组各阶段BBB运动功能评分结果
2.3 NG-OECs复合体移植修复脊髓损伤超微结构观察
术后3周临近脊髓损伤区近端的脊髓前、后角取出组织透射电镜观察可见，NG-OECs复合体移植组脊髓有较多增生组织填充，脊髓组织中无明显空腔，空泡小而少，神经纤维及细胞坏死较少，色泽较亮;而对照组有较多空腔状，白质中有许多微囊，神经纤维及细胞坏死，颜色较暗，在横断处附近形成较多空泡;8周时上述差别更明显。
2.4 脊髓组织切片的荧光观察和免疫组织化学染色结果
冰冻切片荧光显微镜下表现，NG-OECs复合体实验组：3周标本，hoechst标记的OECs多集中于注射部位，荧光比较强;6周后荧光强度渐弱和密度降低(对比3周)，细胞可迁移至原注射部位15～3.5mm远处，提示细胞移植后向周围迁移。对照组为阴性。移植细胞成瘤性检测：利用移植后长时间(大于半年)存活的动物，采集20只，在电镜下观察移植OECs均未发现明显异型性。
3 讨论
传统观点认为，哺乳动物的脑和脊髓损伤后不能再生，因而半瘫或全瘫症状如果不能在伤后24h内得到改善，则不会有明显的功能恢复。最近，经研究发现CNS有再生功能，神经损伤后的修复能力取决于多种因素的影响。目前认为脊髓损伤后难以恢复的主要原因包括：(1)对脊髓的直接打击及继发炎症使脊髓内功能神经元大量坏死，右旋糖苷生物素顺行标记显示：再生的皮质脊髓束损伤凋亡且神经元再生困难;(2)脊髓损伤后暴露的髓鞘相关抑制分子及继发形成的胶质瘢痕阻碍了轴突的生长和正确连入灰质形成终末分支。(3)损伤造成局部细胞凋亡，致使细胞分泌的神经营养因子减少，破坏了支持轴突再生的有利微环境[9]。本实验中观察到：伤后3周实验组和对照组后肢运动功能有轻微恢复;细胞移植4周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分明显高于对照组，有统计学差异(P<0.05)。6周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分提高更为显著，且两组BBB评分差值有增大趋势，提示NG-OECs复合体移植可能对SCI大鼠后肢运动功能恢复有促进作用(表1)。组织学方面对嗅鞘细胞移植组、对照组脊髓损伤区和对照组相同节段CST区域嗜银染色进行神经纤维计数，其结果为NG-OECs复合体移植组(544.7±102.2)，对照组(2212.8±175.4)。两组之间差异有显著性(P<0.05)。这也与实验中BBB运动功能评分所得到结果相符。细胞移植后3周左右，注射部位可检测到强而且密集的蓝色荧光;6周后检测到荧光强度渐弱和密度降低但分布更为广泛。提示细胞由注射部位向周围缓慢迁移，部分细胞甚至越过损伤头尾两端(P75染色)，迁移至原注射部位1.5~3.5mm远处，在迁移过程中和周围组织逐渐融合并发挥支持作用。笔者认为移植的NG-OECs复合体在脊髓损伤修复过程中可能发挥如下作用：(1)支持脊髓神经元轴突再生和突触重建。嗅神经终身可以再生，并且再生轴突可穿越周围神经系统与中枢神经系统的交接区，重新长入中枢神经系统的嗅球并建立起突触联系，嗅神经元(olfactory sensory neumns，OSNs)的强再生能力与嗅觉系统内嗅鞘细胞的独特作用密不可分，OECs包被着嗅神经轴突，并且诱导嗅神经长入神经中枢，决定了OsNs轴突终身再生的生理特性;(2)OECs能表达多种细胞表面粘附分子，如层粘连蛋白(1aminin)、细胞粘连分子LI(cell adhesion molecule)等促进神经轴突生长;(3)OECs还能分泌多种神经营养因子，如神经营养素(NT-3)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等，这些神经营养因子对于神经元的成熟具有促进作用。临床上，脊髓损伤患者中横断伤疗效最差，笔者的动物实验模型与其相吻合：因此本实验结果为临床脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植后的神经功能恢复，从理论上奠定了基础、提供了依据。结合实验研究笔者认为，嗅鞘细胞移植后，脊髓损伤晚期患者神经功能恢复的机制在早期可能以脱髓鞘后髓鞘化等损伤修复作用为主，随后可能兼有损伤修复和神经再生两方面的作用，最后则可能以神经再生的作用为主。
【参考文献】
1 Woerly S, Doan VD, Evans-Martin F, et al. Spinal cord reconstruction using NeuroGel implants and functional recovery after chronic injury. J Neurosci Res，2001，15，66(6):1187-1197.
2 Woerly S, Doan VD, Sosa N, et al. Prevention of gliotic scar formation by NeuroGel allows partial endogenous repair of transected cat spinal cord. J Neurosci Res，2004，15，75(2):262-272.
3 Woerly S, Pinet E, de Robertis L, et al.Spinal cord repair with PHPMA hydrogel containing RGD peptides (NeuroGel). Biomaterials，2001，22(10)，1095-1111.
4 Woerly S, Doan VD, Sosa N, et al. Reconstruction of the transected cat spinal cord following NeuroGel implantation: axonal tracing, immunohistochemical and ultrastructural studies. Int J Dev Neurosci，2001，19(1):63-83.
5 Vincent AJ, West AK, Chuah MI.Morphological and functional plasticity of olfactory ensheathing cells. J Neurocytol，2005，34(1-2):65-80.
6 Collazos-Castro JE, Muneton-Gomez VC, Nieto-Sampedro M. Olfactory glia transplantation into cervical spinal cord contusion injuries. J Neurosurg Spine，2005，3(4):308-317.
7 Sasaki M, Hains BC, Lankford KL, et al .Protection of corticospinal tract neurons after dorsal spinal cord transaction and engraftment of olfactory ensheathing cells. Glia，2006，53(4):352-359.
8 Marshall CT, Lu C, Winstead W, et al. The therapeutic potential of human olfactory-derived stem cells. Histol Histopathol，2006，21(6):633-643.
9 Reier PJ.Cellular transplantation strategies for spinal cord injury and translational neurobiology.Neuro R,2004，1：424-451.