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【摘要】 目的 探讨温下肠腑方对1，2-二甲基肼(DMH)诱导的大鼠大肠癌的预防作用。方法 DMH腹腔注射诱导大鼠发生大肠癌，观察温下肠腑方对死亡率、胸腺指数、脾指数及癌前病变-变性隐窝病灶计数的影响。结果 本研究用DMH成功诱导大鼠大肠癌模型，温下肠腑方组大鼠死亡率低于模型组，变性隐窝计数显著低于模型组(P<0.05)，胸腺指数、脾指数、体重高于模型组，且差异均有显著性(P<0.05)。结论 温下肠腑方对DMH诱导的大肠癌具有预防作用，并具有一定的免疫提高作用。
【关键词】 大肠癌;二甲基肼;温下肠腑方;大鼠
【Abstract】 Objective To observe the prevention of Wenxiachangfu recipe against colorectal cancer in rats induced by 1,2-dimethylhydrazine(DMH).Methods The colorectal cancer model was formed by DMH interaperitoneal injection.The effects of Wenxiachangfu recipe on the death rate , on spleen index and thymus index，on the number of aberrant crypt foci(ACF) were observed.Results The colorectal cancer model was successfully established in this experiment. the death rate,the number of ACF of the Wenxiachangfu recipe group were lower than those of the model group, while the weight, the spleen index and thymus index of the former higher than those of the latter group, the differences being statistically significant(P<0.05).Conclusion Wenxiachangfu recipe can prevent colorectal cancer induced by DMH and improve immune function.
【Key words】 colorectal cancer; dimethylhydrazine; Wenxiachangfu recipe;rat
结直肠癌在西方国家恶性肿瘤发病中排名第二，在欧美国家中每年新增病例达30万，其致死病例在恶性肿瘤中也居第二位，要提高结直肠癌患者的生存率，延长其生存期，早期诊断与早期治疗显得尤为重要。中医药以其辨证论治、多靶点治疗的优势在肠癌的防治，尤其提高机体免疫机能，提高生存质量等方面发挥着不可替代的作用。研究显示，温下肠腑方对大肠癌相关基因bcl-2等的表达有一定调节作用[1，2]，本研究通过腹腔注射1，2-二甲基肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH)建立大鼠大肠癌模型，进一步观察温下肠腑方对该模型死亡率、胸腺指数、脾指数及大鼠癌前病变-变性隐窝病灶(aberrant crypt foci，ACF)计数的影响，报告如下。
1 材料
1.1 动物
健康成年Wistar大鼠180只，雌雄各半，体重170～220g，由山东大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK鲁20030004。
1.2 药物
温下肠腑方由人参、大黄、附子、当归组成。人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的根，大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的根，附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx的旁生块根，当归为伞形科植物当归Angellica sinensis Diels.的根，经山东中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品。方中人参、大黄、附子乙醇提取2次，当归水提挥发油后与余3味共同浓缩至浓度0.6g/ml，4℃冷藏备用。
1.3 试剂
1，2-二甲肼(DMH)购自美国Aldrich公司，注射前溶于含0.18%乙二胺四乙酸(EDTA)的生理盐水中，1M NaHCO3调pH值至6.5～7.0。
2 实验方法
2.1 实验动物分组
实验动物随机分为对照组、模型组、温下肠腑方组，每组60只。第5周、第10周、第15周时间点，每组分别处理10只大鼠。第20周、第23周每组分别处理15只大鼠。
2.2 实验动物造模及给药方法
对照组按1ml/200g体重腹腔注射1mmol/L EDTA，其余各组按5mg/200g体重腹腔注射DMH，1次/周，连续23周。温下肠腑方组从造模开始按1.95g生药/200g体重灌胃给以温下肠腑方，其余各组灌胃给予等容积生理盐水，每周连续6天。
2.3 实验动物处理及胸腺指数、脾指数计算
各组动物分别于第5周、第10周、第15周、第20周和第23周称量体重，并分别于相应时间点处死，取出大鼠胸腺及脾脏后分别称重，计算胸腺指数=100×胸腺重量/体重，脾指数=100×脾脏重量/体重。
2.4 变性隐窝计数
按陈锋等[3]报道方法计数，动物处理后立即分离并漂洗大肠。将大肠平铺于加有10%Formarline的滤纸上，压载玻片以防大肠卷曲，于4℃固定24～36h后，以0.2%亚甲蓝染色3～5min，立即观察计数变性隐窝数目。变性隐窝的确定：按Bird和Mclellan描写的变性隐窝特征确定并计数变性隐窝和变性隐窝病灶[4]，每样本计数3次取平均值。
2.5 统计学处理
采用SPSS14.0统计学软件进行分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示。多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较用独立样本t检验，两个样本率的比较用U检验，以P<0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 相同时间点实验大鼠死亡率比较
结果见表1。实验结果表明，DMH腹腔注射至15周、20周、23周时间点，模型组及中药干预组死亡率均升高。温下肠腑方干预后，与模型组比较，20周、23周动物死亡率明显降低，差异有显著性(P<0.05)。表1 相同时间点实验大鼠死亡率比较
3.2 相同时间点实验大鼠的体重变化比较
结果见表2。在15周、20周、23周时间点，与对照组相应时间点比较，模型组体重明显降低，差异有显著性(P<0.05，P<0.01);在23周时间点，与模型组相应时间点比较，温下肠腑方组体重明显增高，差异有显著性(P<0.05)。表2 相同时间点实验大鼠体重变化比较
3.3 相同时间点实验大鼠大肠肿瘤发生情况比较
结果见表3。在5、10、15、20、23周时间点，与对照组相应时间点比较，模型组大鼠变性隐窝数量明显增多，差异有显著性(P<0.01);在15、20、23周时间点，与模型组相应时间点比较，温下肠腑方组变性隐窝数量明显降低，差异有显著性(P<0.05)。表3 相同时间点实验大鼠变性隐窝数比较
3.4 相同时间点实验大鼠胸腺指数、脾指数的比较
结果见表4。在15周、20周、23周时间点，与对照组相应时间点比较，模型组胸腺指数、脾指数明显降低(P<0.05);与模型组比较，温下肠腑方组胸腺指数、脾指数明显提高(P<0.05)。说明温下肠腑方能显著提高大鼠免疫功能。表4 相同时间点实验大鼠胸腺指数、脾指数变化比较
4 讨论
大肠癌属于中医学“肠覃”、“积聚”、“肠风”、“脏毒”等范畴，其发病多因饮食失节，损伤脾胃，致脾虚不运，毒邪内生，蕴结肠道，渐而成积。如金·张元素指出：“壮人无积，虚人则有之。脾胃怯弱，气血两衰，四时有感，皆能成积”;《景岳全书》载：“凡脾胃不足及虚弱失调之人多有积聚之病”。可见，正气虚损是大肠癌发病的内在基础。课题组根据临床及前期研究，认为肠癌病因为阳气虚损，阴寒内生或寒邪内侵，损伤阳气，致寒毒积滞，提出温下法是防治大肠癌的有效思路及方法之一。温下方由附子、大黄、人参、当归四药组成。附子辛热补火助阳，温散寒凝，宣通冷积，配以苦寒之大黄荡涤积滞，活血袪瘀。两药寒温同用，苦辛相合，通降并行，共奏温下之功，合为君药。臣以人参大补元气，补脾益肺，助附子益气温阳。当归补血活血，润燥滑肠，与人参相合气血双补，扶正以助祛邪，并助大黄泻下逐瘀之功，为方中佐药。四药合用，温、补、下、消四法同施，共成温通寒积之剂，使阳气复，寒邪祛，积滞下，瘀血通。腹腔注射DMH是大鼠大肠癌造模的可靠方法，已被广泛使用。DMH是一种强力诱癌剂，其引起的细胞动力学、组织病理学变化和肿瘤形成的分子机制变化等方面均与人类大肠癌的形成过程比较近似。所以本实验采用此方法建立模型。变性隐窝病灶(ACF)是Bird于1987年发现的，被认为是大肠癌癌前病变[5]。有研究证实大肠癌病人组织中ACF的数量和形态与大肠癌危险性密切相关[6，7]。实验结果表明在第23周时间点，温下肠腑方组大鼠死亡率低于模型组。第15周、20周、23周时间点，温下肠腑方组大鼠变性隐窝计数显著低于模型组(P<0.05)。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官。脾脏有助于活化T和B淋巴细胞，进行特异免疫应答。成熟的T淋巴细胞来源于胸腺，胸腺在T细胞的发育、分化和成熟中发挥重要作用，胸腺组织分泌的胸腺素有助于T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞。胸腺指数和脾指数是观察机体免疫功能变化的常用指标。本研究中温下肠腑方组胸腺指数和脾指数均明显大于模型组，与对照组比较接近，结合体重指标，温下肠腑方组体重也明显高于模型组，说明温下肠腑方在抑癌抗癌的同时，能够改善大鼠的免疫功能和增强大鼠体质。以上提示温下肠腑方对DMH诱导的大鼠大肠癌有预防作用，能改善机体免疫功能，改善生存质量，降低死亡率，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤能力可能是温下肠腑方预防治疗大肠癌的作用机制之一。
【参考文献】
1 欧阳兵,季旭明.温下方含药血清诱导肠癌细胞凋亡及对Bcl-2、p53表达的影响.山东中医药大学学报,2006,30(5):382-383.
2 欧阳兵,季旭明.温下方含药血清诱导肠癌细胞凋亡的实验研究.山东中医药大学学报,2005,29(6):467-469.
3 陈锋,张桥.螺旋藻对二甲肼诱导大肠变性隐窝的抑制作用.中华预防医学杂志,1995,29(1):13.
4 Mclellan EA,Bird RP,Medline A.Sequential analysis of the growth and morphologic characteristics of aberrant cryptfoci:Putative preneoplastic lesions.Cancer Res,1991,51:5270.
5 Bird RP.Observation and quantification of aberrant crypts in the murine colon treated with a colon carcinogen:preliminary findings.Cancer Lett,1987,7:147-151.
6 Roncucci L,Stamp D,Medline A,et al.Identification and quantification of aberrant cryptfoci and microadenomas in human colon.Hum Pathol,1991,22:287-294.
7 文彬，黄秋凌.实验性大肠癌模型的建立及中药的干预作用.中药药理与临床，2009 ,25(4):79-31.