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【摘要】 目的 探讨端粒酶活性与胃癌、癌前病变的关系。方法 应用TRAP法对经病理证实的34例胃癌，18例胃粘膜异形增生，14例胃呈肠上皮化生，9例萎缩性胃炎，13例浅表性胃炎进行端粒酶活性测定。结果 胃癌阳性29例（85.3%），异形增生5例（27.8%），肠上皮化生4例（28.6%），萎缩性胃炎1例（11.1%），浅表性胃炎全部阴性。结果表明胃癌与癌旁组织中的端粒酶检测阳性率相比，差异有非常显著性（P<0.01）。结论 端粒酶活性与胃癌的发生密切相关，检测端粒酶活性可为早期诊断提供参考依据。
关键词 胃癌 端粒酶 PCR-TRAP
Telomeras activity in gastric carcinoma and premalignant lesion
Yang Lin，Ou Yang Gui，Deng Heng，et al.
The First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang421001，Hunan，China.
【Abstract】 Objective To study the role of telomerase activity in human gastric carcinoma.Methods Telomeras activity levels were measured in34cases of gastric carcinoma and18cases of heterogenic hyperplasia，14cases of intestinal metaplasia，9cases of altrophic gastritis and13cases of superficial gastritis by useing PCR-based telomeric repeat amplication protocol.Results It was found that the telomeras activity was positive in29（85.3%）of34human gastric carcinoma，in5（27.8%）of18heterogenic hyperplasia，4（28.6%）of14intestinal metaplasia and one of13atrophic gastritis.The telomeras activity of all superfic gastritis were negative.There was a statistically signifˉicant difference in the positive rate of telomerase between gastric carcinoma and other groups（P<0.01）.Conclusion The tolemeras activity may play an important role in develpment of gastric carcinoma and it may be a marker that help the diagnosis.
Key words gastric carcinoma telomeras PCR-TRAP
端粒酶是由RNA和蛋白体组成的复合体，具有逆转灵活性，它能以自身RNA为模板，从头合成端粒，以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短，使其长度保持动态平衡，细胞可获得无限增殖的能力，导致肿瘤的发生。近年有许多文献报道胃癌组织中端粒酶表达率很高，提示端粒酶活化可能是胃癌发生过程中的必经通路。本研究采用PCR-TRAP法检测了34例胃癌患者胃癌组织中端粒酶活性，了解其在胃癌发生、发展中的作用及临床意义。
1 材料和方法
1.1 标本来源及试剂 34例胃癌组织来源于我院2001年10月～2002年9月住院患者的手术切除或胃镜活检新鲜组织，其中男23例，女11例，年龄25～71岁，平均年龄61.6岁，全部病例均经病理证实。肿瘤组织取自肿块的非坏死部分。正常对照54例均来自肿块远隔部位正常组织。患者术前未接受任何治疗。标本离体1h立即放入-85℃冰箱保存。
端粒酶产物依据文献 ［1］ 选择以下产物:TS:5′-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3′，CX:5′-CCC TTA CCC TTA CCC TTA CCC TTA-3′，此产物由上海生物工程公司合成。
1.2 端粒酶活性检测方法
1.2.1 端粒酶重复序列扩增反应 将冷冻组织标本切成小片，立即移入含200μl冰冷裂解缓冲液中，匀浆至均匀一致。冰上孵育30min，16000r/min离心20min（2～8℃），收集上清待查。取3μl裂解上清液，PCR反应混合液25μl，DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的超纯水22μl共50μl于PCR反应管中混合均匀，进行端粒酶重复序列扩增反应，25℃孵育20min后，94℃灭活5min进入PCR循环:94℃30s，50℃30s，72℃90s，30个循环，72℃延伸10min后终止反应。阳性对照为有端粒酶表达的人293细胞株裂解上清，阴性对照为经65℃，10min灭活的人293细胞株裂解上清。
1.2.2 电泳及染色 PCR产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后分别进行银染和EB染色。同时将染色结果对比。阳性结果为经硝酸银或EB染色后可见间隔6bp的梯形条带（图1，2）。当提取液浓度分别为6μg，0.6μg，0.06μg时出现阳性条带表示弱阳性，阳性，强阳性。任何浓度均不出现特异性图谱为阴性。
1.2.3 统计学分析 采用X 2 检验对各标本组端粒酶活性进行统计学处理。
2 结果
2.1 胃癌与不同胃粘膜组织端粒酶活性比较 见表1。
表1 胃癌与不同胃粘膜组织端粒酶活性比较 略
2.2 同一PCR产物进行EB染色和银染结果 见图1，图2。
图1 TRAP-EB染色结果 略
图2 TRAP-银染结果 略
3 讨论
国内外已有研究报道 ［1～4］ ，胃癌组织中端粒酶阳性表达率为85%左右。本组报道胃癌组织中端粒酶阳性率为85.3%，与文献报道一致。
端粒是真核生物染色体的物理末端重复DNA序列，对染色体稳定和DNA完整复制起重要作用。端粒酶是一种核糖蛋白体，具有逆转录活性，它能以自身RNA为模板，从头合成端粒添加到染色体末端以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短，从而维持端粒的一定长度与染色体的稳定性。使细胞得以永生化，甚至可致部分细胞无限增殖而形成癌细胞。由于存在细胞分裂的“末端复制问题”和“肿瘤细胞无限增殖特性”的矛盾，使得端粒酶活性在肿瘤成形、发展中 的作用显得较为重要。Shay等 ［5，6］ 报道了近年来不同学者对不同肿瘤端粒酶活性的检测结果，在前列腺、乳腺、胰腺、结肠的早期癌变中，端粒酶的阳性率可高达84%～95%。还有文献报道认为端粒酶可作为上消化道恶性肿瘤的诊断标志，甚至可作为早期诊断的标志 ［7，8］ 。我们通过对34例胃癌患者肿瘤组织端粒酶的检测，发现癌组织与非癌组织之间端粒酶检出率差异存在非常显著性（P<0.01），本研究结论支持端粒酶活性在胃癌的发生、发展过程中起重要作用的观点，认为端粒酶活性检测可为临床诊断提供有价值的重要参考。但值得提出的是，端粒酶活性作为肿瘤诊断标志物，存在专一性差和影响因素多的缺陷，单独使用该项指标时应持慎重态度。在本组34例病人中，就有5例患者未能检出端粒酶表达。对此有人认为存在端粒酶以外的途径，如端粒酶结合蛋白、端粒酶结核等。还有人认为端粒酶本身的激活也有一些因子的调控与影响。这可以解释为什么不是所有的胃癌肿瘤组织都存在端粒酶阳性表达。至于为什么部分良性病变的病例也存在端粒酶阳性表达，则需进一步的研究阐明。
参考文献
1 王旭霞，张盈华，郝晓柯，等.端粒酶活性检测在胃癌诊断中的应用及其临床意义.肿瘤防治研究，2003，30（1）:34-36.
2 毕超，肖创清，黄修海，等.胃癌端粒酶活性及ras基因突发的研究.中国肿瘤临床与康复，2003，10（4）:319-321.
3 杨仕明，房殿春，罗元辉，等.胃癌及癌前组织端粒状态的分析.中华消化杂志，1999，19（5）:301-304.
4 Kakeji Y，Machara Y，Koga T，et al.Gastric cancer with high telomerase activity shows rapid development and invasiveness.Oncol Rep，2001，8（1）:107-110.
5 Greider CW，Blackbum EH.A telomerie seguence in RNA of tetrahyˉmena telomerase reqeatsynthesis.Nature，1989，337:331-332.
6 Shay Jw，Bacchettis A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，1997，33（5）:787.
7 陈雯，张桥，万德森，等.胃癌结肠癌组织端粒酶活性.中华肿瘤杂志，1998，20（4）:261.
8 Bryan TM，Englezou A，Gupta J，et al.Telomere elongation in immortal humancells without detectable telonerase activity.EMBO J.1995，14（17）:4240.
作者单位: 421001 湖南衡阳南华大学附属第一医院