槲寄生Lectin体外对肿瘤细胞的细胞毒性作用

    【摘要】 目的 通过体外实验研究槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞的杀伤作用。方法（1）用相差显微镜观察不同浓度的槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞的杀伤情况。（2）MTT比色分析法测定槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞生长曲线的影响。（3）用流式细胞仪检测槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞的细胞周期的影响。结果 （1）不同剂量的槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞的杀伤作用不同。（2）槲寄生Lectin注射液对Hela细胞和K ₅₆₂ 细胞的生长曲线有明显影响。（3）槲寄生Lectin注射液对Hela细胞和K ₅₆₂ 细胞的细胞周期有明显影响。结论 槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞有很强的杀伤作用，并存在剂量依赖性，不同来源的肿瘤细胞对其敏感度不同。

关键词 槲寄生 肿瘤细胞 细胞周期 细胞毒性作用

In vitro effects of mistletoe lectins: cytotoxicity towards tumor cells

Fu Weixin，Yu Xiaonan，Liang Zaifu，et al.

Department of Clinical Laboratory，Beifang Hospital General Hospital，Shengyang Command110016.

【Abstract】 Objective To study the kilkling effects of mistletoe lectins towards tumor cells in vitro.Methods （1）To observe the killing effects of mistletoe lectins on tumour cells by microscope.（2）To detect the effects of mistletoe lectins on tumour cells’growth curve by，MTT colorimetric analysis.（3）To detect the effects of mistletoe lectins on cell cycle by fluorescence analysis on aFACS can flow cytometer.Results （1）Killing effects of different concentrate mistletoe lectins on tumour cells are defferent.（2）Mistletoe lectins have evident effects on tumour cells’growth curve and thier cell cycle.Conclusion Mistletoe lectins have strong killing effect on tumour cells and its ef_ˉfect depends on drug concentration.

Key words mistletoe lectins（MLs） tumour cells（Hela and K ₅₆₂ cells） cell cycle cytotoxicity

槲寄生（Mistetoe）是生长在落叶乔木和灌木上的寄生植物，近百年来，槲寄生制剂已被用于高血压、痛风、癫痫、肾炎、关节炎、结缔组织病等多种疾病的治疗 ^［1，2］ 。在这些疾病治疗中取得的结果提示，槲寄生提取物对调节某些脏器功能和改善病理损害有着重要作用。近年来，槲寄生提取物的免疫调节活性和对肿瘤细胞的生长抑制活性已成为体外研究的重要课题。本实验采用流式细胞仪技术，观察槲寄生凝集素对肿瘤细胞的细胞周期的影响，同时通过体外实验观察其对肿瘤细胞生长曲线的影响，从而研究槲寄生凝集素对肿瘤细胞的细胞毒性作用，并初步探讨对这种细胞毒性作用的机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 人宫颈癌Hela细胞，人红白血病K ₅₆₂ 细胞，购于中国科学院上海生物学研究所，在本实验室常规传代培养。

1.2 药品 槲寄生Lectin注射液。购于山东绿叶制药有限公司。

1.3 试剂 含10%胎牛（小牛）血清的RPMI-1640培养液、MTT染液、PI染液、PBS缓冲液、枸橼酸钠、NP-40、DM_ˉSO（二甲基亚砜）、丝裂霉素等试剂本实验室备有。

1.4 仪器 FACScan型流式细胞仪（美国Beilin Diekinson ），ELX800型（BIO-TEK Instroment INC）全自动酶标仪，OLYMPUS CK40型倒置显微镜，96孔培养板、12（24）孔培养板、培养瓶，CO ₂ 培养箱，振荡混合仪等。

2 实验内容

2.1 槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞的杀伤作用 取单层培养的Hela细胞和对数生长期的K 562 细胞，用10%FCS RPMI-1640培养液调整成1×10 ⁶ /ml的细胞悬液，分别用不同浓度的槲寄生Lectin注射液处理后接种于12（24）孔培养板中，将培养板置于37℃、5%CO ₂ 及饱和湿度下培养48h，用相差显微镜观察细胞形态的改变。

2.2 槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞生长曲线的影响 采用MTT比色分析法。取单层培养的Hela细胞和对数生长期的K ₅₆₂ 细胞用10%FCS RPMI-1640培养液配成1×10 ⁴ /ml的细胞悬液，分别用不同浓度的槲寄生Lectin注射液处理后将细胞接种于96孔培养板中，将培养板置于37℃，5%CO ₂ 及饱和湿度下培养48h后用MTT染液染色，在酶标仪上以490nm波长测定各组细胞吸光度值，用细胞存活率对剂量对数做图，求出药物对两种细胞的IC 50 值。用同样浓度的槲寄生Helixor注射液分别处理Hela细胞和K ₅₆₂ 细胞，重复上述实验，将结果与前者进行比较。

2.3 槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞细胞周期的影响 采用流式细胞技术。取单层培养的Hela细胞和对数生长期的K 562 细胞，用10%FCS RPMI-1640培养液调整成1×10 ⁶ /ml的细胞悬液，分别用不同浓度的槲寄生Lectin注射液处理，然后接种于12（24）孔培养板中。将培养板置37℃，5%CO ₂ 及饱和湿度下培养48h后，再用PBS液洗涤细胞3次，然后与等体积的PI染液混合，置4℃过夜、染色。次日上流式细胞仪测定DNA含量，所得数据用专用软件计算细胞周期各时相细胞百分比。同时用同样浓度的槲寄生Helixor注射液分别处理Hela细胞和K₅₆₂ 细胞，重复实验，并将两结果进行比较。

3 结果

3.1 槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞的杀伤作用 用相差显微镜观察到不同剂量的槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞的杀伤作用不同。槲寄生Lectin浓度为1μg/ml时Hela细胞和K 562细胞的生长状态均正常;浓度为10μg/ml时，Hela细胞无明显变化;K ₅₆₂ 细胞已受到损伤，部分细胞出现溶解死亡。剂量增至20μg/ml，Hela细胞开始变性，细胞内出现空泡和颗粒;K ₅₆₂ 细胞损伤程度增大，多数细胞萎缩、变性死亡。当药物浓度为40μg/ml时，Hela细胞生长受到明显抑制，大部分细胞变性、死亡;K ₅₆₂ 细胞已全部死亡。剂量增至80μg/ml以上时，Hela细胞也全部死亡。

3.2 槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞生长曲线的影响 不同浓度的槲寄生Lectin注射液分别处理Hela细胞和K ₅₆₂ 细胞，培养48h，测得槲寄生Lectin注射液对Hela细胞的IC ₅₀ 值为36.31μg/ml;对K ₅₆₂ 细胞的IC ₅₀ 值为22.39μg/ml。对照药物Helixoer注射液对Hela细胞的IC ₅₀ 值为61.7μg/ml、对K ₅₆₂ 细胞的IC ₅₀ 值为47.78μg/ml。

3.3 槲寄生Lectin注射液对肿瘤细胞细胞周期的影响

3.3.1 槲寄生Lectin注射液对Hela细胞细胞周期的影响 实验结果见表1所示:Hela细胞经槲寄生Lectin注射液处理后培养48h，药物剂量为10μg/ml时，G ₁ 期细胞百分率明显下降，S期和G ^{2 +}M期百分率明显上升;剂量增至20μg/ml时，G ₁ 期细胞百分率仍明显下降，S期百分率仍继续上升，而G ^{2 +}M期百分率有所下降;剂量增至40μg/ml即可导致细胞死亡。

表1 槲寄生Lectin注射液处理的Hela 细胞细胞周期各期细胞百分比

3.3.2 槲寄生Lectin注射液对K ₅₆₂ 细胞细胞周期的影响 实验结果见表2所示:K ₅₆₂ 细胞经槲寄生Lectin注射液处理后培养48h，当药物剂量为1μg/ml时，G ₁ 期细胞百分率已明显下降，S期和G ^{2 +}M期百分率呈上升趋势;剂量增至20μg/ml时，G ₁ 期细胞百分率仍明显下降，S期百分率上升至最值，G ^{2 +}M期百分率有所回降;剂量增至40μg/ml，细胞 大部分被杀死。

表2 槲寄生Lectin注射液处理的K 562 细胞细胞周期各期细胞百分比

3.3.3 槲寄生Helix