培养骨骼肌成肌细胞进行心肌内移植的实验研究

  【摘要】 目的 探讨用组织块法体外培养骨骼肌成肌细胞并进行心脏移植治疗心肌梗死的可行性。方法 以21只Wistar大鼠为模型，随机分成二组:细胞移植组和对照组。细胞移植前，用液氮冷冻法制作左室前壁心肌梗死动物模型。同时用组织块法培养所需成肌细胞。2周后把培养的成肌细胞注射到心肌疤痕中，用生理记录仪测定移植前后的左心室功能，所有数据以均数±标准差（X±s）表示，并行组间配对比较t检验。结果 采用组织块法培养原代骨骼肌成肌细胞取得了预期的结果，48～72h后见到成肌细胞从组织块边缘游离，呈梭状，细胞形态一致。数据分析表明:移植前，对照组与移植组相比，左室收缩和舒张功能无明显差异（P>0.05）;移植后，移植组左心功能比对照组有明显改善（P<0.001）。结论 组织块法能较好培养出原代骨骼肌成肌细胞，与酶消化培养法结果一致，且方便、有效;培养的自体骨骼成肌细胞移植心肌能有效地修复心肌疤痕组织，抑制心室重构，改善心肌梗死后心脏收缩及舒张功能。

　　关键词 骨骼肌成肌细胞 细胞原代培养 组织块法 细胞移植

　　Experimental research on myoblasts gotten by tissue culture

　　in vitro transplantation to myocardium

　　Sang Xuedong，Ji Xiaoping，Liu Jianmin

　　Department of Cardiology，Zhangzhou Municipal Hospital，Zhangzhou363000.

　　【Abstract】 Objective To investigate the feasibility of autologous skeletal myoblasts gotten by tissue culture in vitro and transplantation for treatmentof acute myocardial infarction.Methods 21Wistar rats were divided into two groups randomly:cell transplantation group and control group.Myocardial infarction model are gotten by cryoinjury with liquid nitrogen on the anterior wall of left ventricle before cell transplantation.In the meanwhile，skeletal myˉoblasts werecultured by tissue culture.Two weeks later，myoblasts being cultured in vitro were injected to myocadial scar.The left ventricular function of all animals was meaured usingphysiological recorder at the time of transplantation and four weeks later.All values are expressed as the mean±standard error（mean±SEM）.The differences in the data between easch two groups were determined with a Student’stest.Results Tissue culture could effectively culture initial skeletal myoblasts from muscle tissue at48～72hours after initial culture，which appeared uniform，showing spindle or long spindle cells.The statistical figure indicate that left ventricle systolic and diasitolic function of cell transplantation group have no the significant differences with control group before transplantation（P>0.05）.The left ventricle function in the transplanted group has significant progress than the control group（P<0.001）.Conclusion Tissue culture can effectively isolated skeletal myoblasts from muscle tissue.Typical morphological changes are show
n in skeletal myoblasts when in vitro cultured.This way is convenient effective and feasible;Autologous skeletal myˉoblasts myocardium transplantation are effective for improving left ventricular function，mending myocardial scars and preventing myocardium remodeling.

　　Key words skeletal myoblast cell primary culture tissue culture cell transplantation

　　细胞心肌成形术（cellular cardiomyoplasty，CCM）就是把体外培养的肌源性细胞或其他干细胞移植到受损心肌中，令其分裂、增殖，以此达到抑制心室重构、改善心脏功能的一种生物技术。自20世纪90年代初以来，众多的动物模型证实:平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞及骨髓间质干细胞移植于受损心肌后，能在宿主中存活、增殖，并诱发局部毛细血管增生，使瘢痕组织增厚和瘢痕面积减少，抑制了心室重构，改善了心肌缺血和心脏功能，心肌内移植或其它  干细胞作为修补梗死心肌的方法及疗效已得到肯定。体外获得足够多的移植细胞是实验成功的关键。本文拟用组织块法体外培养骨骼肌成肌细胞，避免酶消化法易污染，实验成本高、方法烦琐。并进行细胞心脏移植来探讨成肌细胞在心肌梗死治疗中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 胰蛋白酶、高糖型DMEM、成纤维生长因子（bFGF）、磷酸缓冲盐（PBS）、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司;链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒产品编号KIT9701，抗肌凝蛋白抗体，均购自福州迈新生物技术开发公司。

　　1.2 实验动物及分组 21只Wistar大鼠，体重280±20g，雌性，购自山东大学实验动物中心。将大鼠随机分成二组，即细胞移植组（n=11）和对照组（n=10）。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 大鼠心肌梗死模型的建立 Wistar大鼠21只，腹腔分别给予1%戊巴比妥钠（30mg/kg体重）麻醉，同时肌肉注射0.1mg阿托品;无菌条件下用剪刀沿气管正中线切开，钝性分离肌肉组织暴露出气管。在气管上用眼科剪横向切开一小口，插入自制导管，接动物专用微型呼吸机（江湾Ⅰ型），给予正压通气，调节呼吸频率（60次/min），潮气量3ml/100g体重;75%碘伏消毒胸前皮肤，于左侧第四肋间用手术剪剪开皮肤，逐层分离打开胸腔，并用开胸器固定切口弃分暴露出左心室前壁;将放在液氮中的不锈钢棒（0.5cm，置于液氮中的时间每次不少于5min）取出，直接接触左室游离壁，重复5次，每次不少于20s;用4#丝线关闭胸腔，肌注青霉素（4万U/只）。待动物自主呼吸恢复后撤掉呼吸机，标记动物，分笼饲养。

　　1.3.2 骨骼肌成肌细胞原代培养、纯化、增殖 在制取心肌梗死模型的同时，无菌条件下剪取大鼠后肢伸肌组织2～3g，用含双抗（青霉素5000IU/ml-链霉素5000μg/ml）的PBS平衡盐冲洗4遍，眼科剪剪成1mm×1mm×1mm大小碎块;用弯头吸管将组织小块移到50ml培养瓶底并排放均匀，间距0.5cm，吸入5～8ml含20%（vol/vol）胎牛血清、100μg/mlbFG的DMEM培养液，置于5%CO 2 恒温孵箱内培养。为了防止培养出成肌细胞在高密度状态下分化生成肌管细胞，待细胞全部覆盖瓶壁（<70%）即传代。细胞传代前用Percoll非连续密度梯度离心的方法纯化。向一较细的10ml离心管内依次加入60%和20%的Percoll细胞分离液各2ml，最后加入细胞悬液2ml，注意各层面清楚，15000r/min离心5min，收集中层细胞液，用5ml DMEM培养液稀释; 再次离心（1000r/min×5min）后，弃上清液，沉淀细胞用含20%（vol/vol）胎牛血清、100μg/ml的DMEM培养液重新悬浮，显微镜下计数，调整细胞浓度至104～105/ml，每瓶10ml移至50ml培养瓶传代;每天相差显微镜下观察细胞生长情况并记录，根据实验要求和细胞生长情况进行换液。

　　1.3.3 细胞心脏移植 移植前培养好的成肌细胞用酶消化法制成细胞悬液，调节细胞浓度4～5×10 6 cell/ml，移植前用台盼蓝排斥试验检测移植细胞的活力。用于移植细胞活细胞数达到95%以上。如心梗模型建立时相同，充分暴露大鼠心脏，用皮试针管抽取100μl细胞悬液，注入心肌疤痕中，注射时用无菌棉签固定心脏;对照组注入等量的不含任何细胞的DMEM液。

　　1.3.4 左心室功能测定 细胞移植前、细胞移植后4周两次经颈动脉插管，用八道生理记录仪记录左室收缩压（LVSP）和舒张末期压（LVEDP），左室发展压（LVDP=LVSP-LVEDP）为前二者之差。LVSP、LVDP反映左室收缩功能，而LVEDP反映左室舒张功能。

　　1.3.5 心肌疤痕S-P免疫组织化学染色 移植组6份、对照组5份大鼠心脏标本放入福尔马林中过夜，送山东大学齐鲁医院病理实验室，用S-P免疫组化染色的方法进行疤痕区骨骼肌肌凝蛋白重链检测。

　　1.3.6 心肌疤痕组织透射电镜检查 移植组、对照组各5 个心脏标本用3%戊二醛前固定，送山东省医学科学院电镜室，观察移植区心肌超微结构。

　　1.4 统计学处理 所有数据以均数±标准差（X±s）表示，采用SAS6.12统计学软件包进行t检验。

　　2 结果

　　2.1 移植前后左心室功能测定对比 见表1。表1 移植前后左心室功能对比（略）移植前，移植组与对照组LVSP、LVDP、LVEDP等反映左室功能的各项指标无明显差异（P>0.05）。移植后，移植组LVSP、LVDP均值明显高于对照组及移植前（P<0.001）;而LVEDP则显著低于移植组和移植前（P<0.001）。相反地，移植后对照组LVSP、LVDP均值较移植前明显降低，而LVEDP较前显著升高，P均<0.001。

　　2.2 疤痕组织的免疫组织化学检查 疤痕组织采用抗肌凝蛋白重链抗体免疫组织化学染色，结果发现，对照组切片中，送检的5例心肌疤痕标本中没有1例出现骨髂肌凝蛋白重链阳性染色，而呈纤维增生等心肌梗死病理改变;细胞移植组发现移植的成肌细胞仍存活，送检的6例心肌疤痕标本中有5例骨骼肌肌凝蛋白重链免疫组织化学染色成棕褐色。

　　2.3 疤痕组织的电子显微镜检查 对照组疤痕组织电镜 下呈现心肌严重损伤:肌纤维断裂，线粒体肿胀，排列紊乱，Z线模糊等心肌坏死及纤维样增生等表现，15000高倍镜下送检5例心肌疤痕标本中没有1例看见有毛细血管管腔或血细胞存在。5例移植组疤痕组织标本中有4例在电镜下发现梗死区有类心肌样肌纤维结构，看到肌纤维Z线及较丰富的线粒体;并在新生心肌中看到血液中的红细胞和毛细血管管壁结构。

　　3 讨论

　　近年来，细胞心肌成形术成为国内外学者研究的热点。大量的实验研究