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【摘要】 目的 探讨大鼠肝、肾、睾丸、脾DNA TOPOⅡ活性与衰老的关系。方法 从3月龄和20月龄雄性大鼠上述组织提取TOPOⅡ，电泳后用凝胶成像分析系统进行定量分析，比较二者TOPOⅡ活性。结果 老年大鼠TOPOⅡ的活性明显低于青年大鼠。结论 TOPOⅡ活性下降是引起衰老的重要原因之一。
关键词 TOPOⅡ 衰老 补肾益精
随着老龄化速度的加快，如何提高生命的质量，延长人类寿命，已引起全球普遍关注，抗衰老已成为热点研究课题之一。近年来，有关单氨氧化酶、端粒酶和超氧化歧化酶等与衰老方面的研究颇多，但DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoisoˉmeraseⅡ，TOPOⅡ）与衰老关系的研究未见报道。TOPOⅡ是生物界普遍存在的核酶，与DNA复制、修复、转录、重组及细胞增殖密切相关。因此研究机体内TOPOⅡ变化，应是探讨衰老机制的切入点之一。我们通过观察青年大鼠和自然衰老大鼠不同组织TOPOⅡ活性差异，初步探讨探讨衰老机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar雄性大白鼠购自中国科学院实验动物研究所，实验动物分为老年组和青年组，老年大鼠20月龄处死，青年大鼠3月龄处死。由本所二级动物室饲养。
1.2 试剂 蛋白酶K、PMSF（苯甲基碘酰氟）、ATP、DTT、BSA为Sigama产品。SDS为华美公司产品。pBR 322 DNA为宝生物（大连）工程公司产品。其它均为国产及进口分析纯试剂。
1.3 缓冲液 缓冲液A，50mmol/L Tris-HCL pH7.5。25mmol/L KCl，3mmol/L MgCl 2 ，2mmol/L CaCl 2 ，0.25mol/L蔗糖，1mmol/L PMSF。缓冲液B，同缓冲液A，但蔗糖为0.6mol/L。缓冲液C，同缓冲液A，但除去CaCl 2 ，加入5mmol/L MgCl 2 。缓冲液D，同缓冲液C，但除去蔗糖。缓冲液E，80mmol/LTris-HCl pH7.5，2mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.53mol/L NaCl，10%甘油。缓冲液F，200mmol/L Tris-HCl pH7.5，340mmol/L KCl，40mmol/L MgCl2 ，20mmol/L DTT，120μg/ml BSA，4mmol/L ATP。
1.4 TOPOⅡ的提取 TOPOⅡ的提取及活性测定参照文献方法 ［1，2］ 并加以改进。将二组大鼠用20mg/ml戊巴比妥钠麻醉，立即剖腹取出肝、肾、睾丸、脾，放冰冷的生理盐水中冲洗2～3次，用滤纸吸去水分。各取肝、肾、睾丸、脾约200mg，剪碎，加入4ml0.83%NH 4 Cl缓冲液（NH 4 Cl0.83g，NaHCO 3 0.1g，EDTA-Na 2 0.033g，溶于100ml水中），用玻璃匀浆器匀浆。用120目尼龙布过滤匀浆液。滤液2000rpm离心15min，去上清。沉淀加入2ml缓冲液A混悬，冰浴2min，沿管壁慢慢加入0.6ml缓冲液B，2500g离心10min。沉淀悬浮于2ml缓冲液C中，2500g离心10min。沉淀悬浮于220μl缓冲液D，加入22μl0.2mol EDTA，490μl缓冲液E，轻轻摇振，冰浴30min，40，000g离心20min。保留上清液（含DNA TOPOⅡ），一部分用Folin法测定蛋白质;一部分加等体积甘油及BSA和PMSF（终浓度为1mg/ml和0.5mM/L），-20℃保存，用以测定酶活性。以上操作均在4℃或冰浴下进行。
1.5 酶活性测定 1μgPBR 322 DNA加入5μl缓冲液F，混匀后，加入适量的酶液，空白管不加酶液，加水补充至20μl。充分混匀后37℃温育30min，加2μl10%SDS及2μl10μg/ml的蛋白酶K中止反应。再继续37℃温育30min，加2μl溴酚兰，点于0.9%的琼脂糖上电泳。溴乙啶染色40min。用凝胶成像分析系统照像并进行定量分析。使1μg PBR 322 超螺旋DNA完全被酶解为一个酶活性单位。
1.6 TOPOⅡ的量效关系 1μg PBR 322 DNA加入5μl缓冲液F，混匀后，加入0.06、0.04、0.02、0.01、0.005μg TOPOⅡ提取液，其余操作同酶活性测定，r=0.92。TOPOⅡ的量效关系电泳见图1。
图1 TOPOⅡ的量效关系 A道为对照（不含酶）， B～F道分别加入0.06，0.04，0.02， 0.01，0.005μg TOPOⅡ提取液
1.7 统计方法 使用“药理统计好帮手”（2.02版）做多组t检验，结果以X±s表示，方差齐性的两样本均数比较采用t检验，方差不齐的两样本均数采用t′检验。
2 结果
2.1 大鼠整体及解剖观察 老年大鼠随着年龄的增大，弓背、懒动、毛色枯黄等现象日趋明显。解剖肝、肾、睾丸、脾等组织，睾丸变化最大，青年大鼠睾丸色泽白而大;而老年大鼠睾丸色泽枯黄而特别小。青年大鼠的组织色泽红润弹性强;而老年大鼠的组织色泽黯淡脆软无弹性，犹如豆腐渣样。
2.2 大鼠不同组织TOPOⅡ活性测定结果 见表1。从表1可看出，青年大鼠对照组TOPOⅡ活性明显高于老年对照组（P<0.01），差异有极显著性。青年大鼠肝、肾、脾TOPOⅡ活性是老年组2倍多，而睾丸是老年组6倍多，这可能说明老年大鼠生殖细胞衰老最快。
表1 青老年大鼠各组织TOPOⅡ活性变化比较
注:与老年对照组比较，ˇP<0.01
3 讨论
3.1 TOPOⅡ与衰老相关 TOPOⅡ是生物界普遍存在的核酶，通过调节核酸结构动态变化，可以催化DNA超螺旋与解旋之间的相互转换，而DNA的碱基对组成、数目、顺序不会发生任何变化。它与DNA复制、修复、转录、重组及细胞增殖密切相关。无论是真核细胞还是原核细胞，通常情况下，细胞DNA以超螺旋为主要存在形式。当需要复制、转录时，DNA必须解旋，缓解DNA键的张力，以利于复制或转录过程的正常进行，更重要的是让DNA分子中的结合位点暴露出来，从而使参与复制与转录的各种调控蛋白发生作用。当复制或转录完成后，亲代与子代DNA分离，则又要求由解旋状态恢复到超螺旋状态 ［3］ ，由此可见TOPOⅡ是细胞生命活动中最重要的酶之一。TOPOⅡ活性降低直接影响细胞的正常分裂，使细胞的增殖能力减退，甚至完全停滞，功能细胞难以更新，脏器萎缩、机能衰退，加速生物老化。从本文实验结果可看出，青年对照组大鼠TOPOⅡ活性远远高于老年对照组。由于老年大鼠TOPOⅡ活性下降，使DNA不能正常复制，影响细胞的正常分裂，导致机体衰老。提示TOPOⅡ活性下降，是引起机体衰老的重要原因之一。
3.2 TOPOⅡ可作为衰老指标之一 青年对照组大鼠肝、肾、睾丸、脾TOPOⅡ活性明显高于老年对照组，特别是睾丸尤为显著，青年组睾丸TOPOⅡ活性（X±s=44.1±4.7）是老年组（6.9±2.1）的6倍多。从解剖也可以看出青年组大鼠睾丸大、色泽白、有弹性;而老年组大鼠睾丸小、枯黄、无弹性，且呈豆腐渣状。这些指征与中医理论相符。中医认为人到老年肾精枯竭，无生育能力。睾丸内的细胞是传宗接代的生殖细胞，能把蕴藏在DNA中的信息遗传给下一代。老年大鼠不能繁衍后代，重要原因之一，就是TOPOⅡ活性严重下降，使DNA不能正常复制。因此应把TOPOⅡ作为判断是否衰老的重要指标之一，它的优点在于青、老年大鼠之间TOPOⅡ活性的差异极为显著，即使是受到个体差 异等因素的影响，也不会造成判断上的困难。
3.3 补肾益精可能是通过提高老年大鼠TOPOⅡ活性，起到抗衰老作用。引起衰老的因素很多，其中肾虚是引起衰老的主要原因之一。中医学认为肾藏精，包括先天之精和后天之精。先天之精禀于父母，与生俱来，是形成生命的原始物质，具有生殖繁衍的作用。后天之精来源于食物所化生的精微物质，通过心脉输布全身，以起营养脏腑、组织器官，维持人体生命活动，促进生长发育之功能。人到老年，肾气渐衰，月经闭止，精气难充，生育无能，齿落发枯，形体渐渐衰老。这充分说明“肾为先天之本”、“生命之根”，肾中精气盛衰是机体“生长壮老已”的根本。中医历代延缓衰老的方剂中，以补肾益精为主的占70%。现代很多研究业已证明补肾益精是延缓衰老的有效方法之一。徐品初等 ［4］ 采用果蝇寿命试验，观察不同补肾方药对果蝇寿命的影响，结果证明，虽然肾虚有肾精亏损、肾气虚、肾阳虚、肾阴虚的差别;补肾有填肾精、补肾气、滋肾阴、温肾阴、阴阳双补之不同，但补肾益精延缓衰老的作用最为显著。我们近年来的研究工作也证明，补肾益精能促进RNA的转录和蛋白质的合成 ［5］ ，提高SOD、DNAase活性及降低RNAase活性 ［6］ 。我们现在的研究工作已证明补肾益精方药确能提高老年大鼠TOPOⅡ活性，起到抗衰老作用，但仍需深入研究。综上所述，TOPOⅡ活性下降，是引起机体衰老的重要原因之一。补肾益精可能是通过提高老年大鼠TOPOⅡ活性，起到抗衰老作用。
参考文献
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3 李玉梅，李志裕，王华，等.拓扑异构酶与抗癌药.药学进展，1996，20（3）:138-142.
4 徐品初，赵伟康，林水淼，等.各补肾中药方对果蝇寿命影响的比较研究.老年学杂志，2000，20（2）:107.
5 张杰，崔成德，徐琦.不同补肾方剂对老年前期小鼠不同脏器细胞核体外RNA转录和无细胞提取液蛋白质合成活性的影响.中国中西医结合杂志，1998，18（9）:550-552.
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作者单位:100700北京中国中医研究院基础理论研究所