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Rao Yan，Fang Zeqiang，Dan Mingbin，et al.
Department of Dermatology the First People’s Hospital，Chongqing400011.
【Abstract】 Objective To explore the changes of growth characteristics，telomerase activity and expressing level of human telomerase reverse transcriptase（hTERT）in rabbit mandibular condylar chondrocytes after transfected by hTERT gene and analyse its significance.Methods Introduction of hTERT gene into rabbit mandibular condylar chondrocytes by eukaryotic vector，selected by G418and culture the positive clones;To detect the growth characterisˉtics of positive clones and no transfected chondrocytes;To examine the telomerase activity and mRNA level
of hTERT gene in chondrocytes by TRAP or hybridization in situtechniques respectively.Results Compared with no transfected chondrocytes，tranfected chondrocytes have a shorter population doubling time（PD）and an extensive lifespan，can be subcultures to100passages and still show the potential of division.Meantime，transfected chondrocytes demonstrate telomerase activity and have positive expression of hTERT gene.Conclusion The rabbit mandibular condylar chonˉdrocytes trans
fected by hTERT gene have telomerase activity，positive，expression of hTERT gene，stronger potential of division，longer lifespan.
Key words chondrocyte hTERT population doubling time telomerase
大量研究表明，端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，具有逆转录活性，不依赖DNA聚合酶，可以与自身携带的RNA模板合成染色体末端端粒的重复序列（TTAGGG），以维持端粒长度的稳定性 ［1］ 。端粒酶通过稳定端粒的长度而使细胞能够继续分裂，增强细胞的分裂增殖能力，进而延长细胞的寿命甚至使细胞获得永生化 ［2］ 。体外研究证明，转染人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）可激活转染细胞的端粒酶活性，使细胞永生化。本研究通过把hTERT转入兔髁状突软骨细胞，来研究hTERT基因对软骨细胞生长特征、细胞寿命和端粒酶活性的影响，并探讨这些变化的意义。
1 材料和方法
1.1 兔软骨细胞的分离、培养 3周龄新西兰大白兔（由军事医学科学院实验动物中心提供）。脱臼处死，无菌条件下剪开颞颌关节，取髁突关节表面软骨，用DMEM（GIBICOL）清洗，剪切软骨至1mm 3 大小，用0.15%Ⅱ型胶原酶消化6h，200目无菌滤网过滤，DMEM洗涤、离心，用含10%FBS 的DMEM培养基稀释（含青霉素、链霉素各100U/ml），在37℃、5%CO 2 孵箱培养。细胞分裂增殖至80%左右汇合时，用0.25%的胰酶消化传代。
1.2 hTERT基因转染 真核表达载体P CI-hTERT （军事医学科学院郭希民博士惠增）和不含hTERT的空载体P CI 采用脂质体转染法，用含G418（GIBCO BRL）（初始浓度为800μg/ml，逐渐减低至200μg/ml DMEM培养基筛选14～21天，挑选阳性单克隆扩增培养，获得稳定表达hTERT克隆并稳定传至100代以上。转染空载体细胞传至10代。
1.3 Ⅱ型胶原染色 ABC法进行转染细胞爬片Ⅱ胶原免疫组织化学检测（一抗为鼠抗人Ⅱ胶原单克隆抗体，1:100，Gibco公司提供）。
1.4 细胞生长曲线的测定 用四唑盐（MTT）比色法测定两组细胞的生长曲线。细胞倍增时间（PD），PD=［log2/（logN t -logN 0 ）］×t，其中N t 和N 0 分别代表接种后和培养t小时后的细胞数。
1.5 端粒酶活性的检测 采用TRAP（PCR-based telomˉerase repeat amplification protocol）法（端粒酶检测试剂盒Sigma提供）检测:PCR:94℃，30s;60℃，30s;72℃，45s;30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用9%聚丙稀酰胺电泳（175V45min，240V1h）进行分离。用试剂盒提供的TSR8作为阳性对照，ITAS（36bp）为内对照。阴性对照以裂解液代替端粒酶提取液，以GAPDH上游引物（5’-CTCAGACACˉCATGGGGAAGGTGA-3’），代替TS引物。TS引物（5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’），CX引物（5’-CCCTTACCCTˉTACCCTTACCCTAA-3’），GAPDH上游引物，均由上海生工生物公司合成。
1.6 hTERT原位杂交检测 采用hTERT原位杂交检测试剂盒（Sigma）进行检测。寡聚核苷酸探针来源于hTERT（1） 1086～1120（序列GGAAGGATGAGTCGAGAGACTCCGGGTCGG ACTGA），（2）2341～2375（序列GCAGAGATGGAACTGTCTGGA GGTCGGCATGTACG，上海生工生物公司合成）。探针使用3’末端转移法进行地高辛标记。杂交方案由试剂盒提供，NBT-BCIP显色。
1.7 转染细胞致瘤性检测 将转染的表皮细胞（1.5×10 8 个）接种于裸鼠皮下，3和6个月取材进行HE染色。
1.8 统计学分析 图像用Fragment Manager图像分析仪（Amersham Pharmacia）进行自动分析。端粒酶活性分析和细胞倍增时间用t检验进行。P<0.01，认为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 未转染的软骨细胞培养从第8代左右开始，细胞生长开始变得缓慢，并停止生长;而转染细胞分裂增殖能力明显增强，其中有6个克隆在半年内稳定传代100次且仍保持旺盛的分裂增殖能力。转染的软骨细胞和未转染的软骨细胞的生长曲线均呈倒置的“S”形，两者的细胞倍增时间分别是26.86h和76.79h，后者是前者的2.85倍，显示转染的软骨细胞持续分裂增殖能力显著增强。统计分析显示，P<0.01，两者差异有显著性意义（图1）。
图1 Culture time（day） （略）
2.2 端粒酶活性检测结果（图2） 阳性克隆的端粒酶活性阳性，阴性对照和未转染hTERT的细胞端粒酶活性则为阴性，两者差异有显著性意义（P<0.01）。
2.3 hTERT mRNA的原位杂交检测结果（图3） 阳性克隆的hTERT mRNA阳性，阴性对照和未转染hTERT的细胞hTERT mRNA则为阴性。
2.4 Ⅱ型胶原染色结果（图4） 细胞爬片可见棕黄色的阳性结果。
2.5 致瘤性检测结果 3个月可见大部分转染的细胞死亡，6个月转染细胞全部坏死、吸收，转染的表皮细胞致瘤性为阴性。
3 讨论
端粒酶是一种核糖蛋白复合体，具有逆转录活性，不依赖DNA聚合酶，可以与自身携带的RNA模板合成端粒重复序列。端粒酶的功能主要在于合成染色体末端端粒的重复序列（TTAGGG），以维持端粒长度的稳定性和延长细胞寿命。研究发现，人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）与端粒酶关系最为密切，是端粒酶的限速因素 ［3，4］ 。hTERT在大多数正常细胞和转化的前永生化细胞中是失活的，而在细胞永生化的过程中被激活。体外研究证明，hTERT的外源性表达及随后端粒酶的活化可使衰老细胞跨越危机点（crisis point）而获得永生化 ［5］ 。因此，除了对端粒酶在癌症的发生和发展以及在癌症治疗方面的作用进行了大量的研究以外，近年来，转染hTERT使细胞永生化以及在组织工程和细胞工程等方面的应用也成为端粒酶研究的另一个热点。实验结果显示，转染hTERT的阳性克隆hTERT mRNA呈阳性表达，端粒酶活性亦呈阳性，而未转染的软骨细胞则hTERT mRNA阴性，也无端粒酶活性;提示体外转染hTERT能激活端粒酶，hTERT在端粒酶激活过程中起重要作用。1991年Harley等提出了端粒假说（telomere hypothesis），认为染色体末端端粒长度对细胞分裂次数具有决定性的作用，在没有其它因素帮助延长端粒时，端粒在细胞复制过程中逐渐缩短，导致细胞退出复制循环而造成细胞出现分裂停滞和死亡。正常软骨细胞在体外培养一段时间后，会出现去分化现象，细胞增殖分裂速度减缓，直至衰老和停止生长;本实验结果表明:未转染hTERT的软骨细胞只能传到8～10代，就出现生长停止和衰老;而转染hTERT的软骨细胞可传至100代，仍然显示旺盛的分裂增殖趋势。这是由于转染hTERT激活端粒酶，稳定端粒长度进而延长软骨细胞的寿命和增强细胞分裂增殖能力的缘故。从两者的生长曲线可以看出，它们的倍增时间分别是26.86h和76.79h，未转染的软骨细胞是转染软骨细胞的2.85倍（P<0.01），说明转染hTERT的软骨细胞持续分裂增殖能力显著增强，造成这种显著差别的原因可能是端粒酶直接作用或使软骨细胞永生化的结果。
图2 （略）
虽然转染的软骨细胞生长速度显著快于未转染的软骨细胞，但是Ⅱ型胶原染色阳性，说明转染的软骨细胞仍然具有软骨细胞的基本特征，能够合成和分泌软骨基质。Gurˉwitz D等的实验证明 ［6］ ，转染hTERT的细胞不具有恶性细胞的特征。当从血清中取出或加入纺锤体抑制剂秋水仙素时，转染的细胞即停止分裂;另外，这些细胞还表现出接触抑制现象，把这些转染hTERT的细胞与matrigel胶一同注入裸鼠皮下，它们不能形成肿瘤。本实验结果也证明转染hTERT并没有使细胞发生恶性改变。
总之，虽然转染hTERT改变了软骨细胞的一些特征，但是转染的软骨细胞仍然具有软骨细胞的基本特征，同时软骨细胞的寿命却得到显著的延长 ［7］ 。hTERT能激活端粒酶和端粒酶的这种显著延长软骨细胞寿命的作用，在医学领域比如软骨组织工程和细胞工程等方面，特别是在软骨组织工程的种子细胞方面可能具有广阔的应用前景，同时也为研究hTERT和端粒酶的作用机制提供了一种细胞模型。
（本文图3，4见封三）
参考文献
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作者单位:400011重庆市第一人民医院皮肤科
100081北京大学口腔医学院颞下颌关节病中心（ Δ 通讯作者）