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关键词 流式细胞术 淋巴细胞亚型 实验室检查
The discussion on the sample storage time for the detection of lymphocytes subtype by flow cytometry
Dong Fang，Chen Lianbo，Ma Ande，et al.
Central Laboratory，the First Military Medical University，Guangzhou510515.
【Abstract】 Objective To discuss the condition of detecting the lymphocyte subtype in human peripheral blood by flow cytometry，and to identify the storage time of the lymphocyte subtype sample.Methods The healthy huˉman peripheral blood samples were collected and stored at4℃.Then the samples were tagged with fluorescent antibody in different times and the lymphocyte subtype was quantified.The specimens tagged with fluorescent antibody were fixed with1%paraformaldehyde and detected at different times.Results When the specimens were stored for10days，there was significant difference in the drop of the CD3 + ，CD4 + and the CD8 + （P<0.05，the18days P<0.01）and there was no significant difference among the CD4 + /CD8 + （P>0.05）.After the specimens were fixed，there was no significant difference among the parameters in1month（P>0.05）.The best time for splitting is from25to30minˉutes.Conclusion The sample of human peripheral blood which was stored at4℃can be used in8days and the fixed specimens can be used in1month.There was great significant in the application of FCM in clinical examination and basic medical research.Key words flow cytometry lymphocyte subtype laboratory examination
流式细胞术（FCM）分析血液淋巴细胞亚型对血液病、肿瘤、免疫性疾病如自身免疫病、免疫缺陷病的诊治，器官移植排斥反应的监测和免疫系统功能如淋巴细胞活化研究等有重要价值 ［1］ 。是一种对单细胞自动定量分析的新技术。FCM检测淋巴细胞亚型，具有简单快速、信息量大、重复性好、灵敏度高、多参数分析等优点，对血液中淋巴细胞亚型的检测比其它方法更精确 ［2］ 。然而，在实验过程中包括自身因素 ［3］ 在内的多种因素均可影响FCM的分析结果 ［4～6］ 。尤其因样品需集中送检或受地理因素和医院设备条件限制，而不能及时检测，样品需要保存。本实验旨在通过检测正常人外周血淋巴细胞中CD3 + 、CD4 + 和CD8 + 细胞数量变化及细胞分群情况，确定流式细胞术检测全血淋巴细胞亚群时样品的有效保存时间。
1 材料和方法
1.1 试剂 流式细胞仪校准微球（三色微球）;免疫表型分析质控细胞（CD-Chex）;（以上为美国BD公司产品）FITC、PE和CY5标记的单克隆三色抗体（CD4/CD8/CD3）;RBC裂解液（以上为美国COULTER-IMMUNOTECH公司产品）;多聚甲醛（天津化学试剂二厂产品）。
1.2 实验仪器 流式细胞仪，COULTER EPICS ELITEESP型（美国BECKMAN—COULTER公司产品）;高速离心机，LD4 -2A型（北京医用离心机厂产品）;台式震荡机，XW-80型（上海第一医学院仪器厂产品）。
1.3 样品 5例健康人外周血各2ml，EDTA抗凝。其中女3例，男2例，平均年龄24岁。
1.4 实验方法
1.4.1 样品制备 5只专用试管内分别加入三标抗体各20μl，抗凝全血100μl，振荡混匀，在25℃室温下避光孵育20min。加入红细胞裂解液500μl，混匀，避光裂解25min。1000rpm离心5min，弃上清后用PBS缓冲液冲洗2次，再加入500μl PBS缓冲液振荡，制成细胞悬液备用。将献血即时处理的样品用1%多聚甲醛（pH=7.4）500μl固定，以封口膜封口并置于4℃冰箱。分别于不同时间FCM检测。另取25支专用试管，分为5组，每组5只。各组间裂解时间分别为15min、20min、25min、30min、40min，以比较裂解时间的影响，其制备方法同上。
1.4.2 FCM检测
激发光波长488nm，发射光波长分别为525nm，575nm，675nm，以标准荧光微球调整仪器hallCV值<2%，根据前向光散射（FSC）和侧向光散射（SSC）将全血细胞分群。设门取淋巴细胞群，每样计5000个淋巴细胞。
1.5 数据分析 所有实验数据均由自动分析后获取，应用SPSS统计学软件，采用重复测量的方差分析检验。结果用均数±标准差（X±s）表示。
2 结果和讨论
2.1 保存不同时间样品的淋巴细胞亚群变化 样品中CD3 + 、CD4 + 及CD8 + 细胞随时间变化有所下降。第10天，下降有显著意义（P<0.05），至第18天，下降更为显著 （P<0.01）。从FSC/SSC散点图看，即时取样细胞分群良好;第8天，细胞尚可分群，对检测结果影响无显著意义（P>0.05）;至第10天，细胞分群受到影响，干扰准确设门，结果受到影响。肉眼观察样品溶血较明显;至第18天，细胞分群不易看出，无法准确设门（图1）。而CD4 + 、CD8 + 细胞比值变化无显著意义（P>0.05）。实验结果表明:外周血样品保存在4℃，8天内的检测值均有统计学意义。至第10天，样品发生溶血，细胞不易分群，检测值下降显著，失去统计学意义，不能再用来作为临床检测标本。CD4 + 、CD8 + 细胞比值变化无统计学意义，可能是由于CD4 + 、CD8 + 细胞值均相应下降所致（表1）。图1 样品保存不同时间（A:即时B:8天C:10天D:18天）的外周血细胞分群图表1 样品保存不同时间淋巴细胞亚型的变化 （略）
2.2 处理后固定样品的淋巴细胞变化 处理样品在固定后其CD3 + 、CD4 + 、CD8 + 细胞数及CD4 + 、CD8 + 细胞比例在30天内均无显著变化（P>0.05表2），散点图可见细胞分群良好。实验表明，1%的多聚甲醛在短期内（1个月）具有良 好的固定效果。操作过程中观察到，细胞荧光强度无显著 降低，细胞分群良好，可以准确设门，对检测结果影响无显著意义。由于检测样品量限制，不能继续采集指标，对于此固定法使其检测结果有意义的最长期限，有待于进一步的检测。表2 处理后固定不同时间淋巴细胞亚型的变化 （略）
2.3 裂解时间的影响 10min时，裂解明显不完全，离心去上清后，管底红细胞沉淀肉眼可见，经缓冲液冲洗后样品仍显粉红色。15min时，以FSvs90LS作直方图中，明显可见红细胞群，干扰准确设门。裂解20min，直方图中红细胞群明显变小，可以准确设门。由于本实验采用了美国COULTER-IMMUNOTECH公司生产的RBC裂解液，对白细胞具有保护作用，故裂解时间较长对结果和设门不会有显著影响。但考虑缩短实验周期，提高效率，认为裂解时间在25～30min较合适，不会影响实验结果（图2）。如采用无保护剂 的裂解液，则需结合本实验室条件进一步确定合适准确的裂解时间，不可裂解时间过长，以免损伤白细胞。以往相关文献大多报道裂解时间为10min ［7］ （有报道3～5min ［8］ ），估计与裂解液不同有关。红细胞裂解一步在检测淋巴细胞亚型中很关键，如红细胞裂解不完全，对检测结果的影响很大，甚至不能准确设门，无法得出结果。所以要尽可能选择含有白细胞保护成分的裂解液，裂解时间可以相对长一些。这更进一步要求各实验室建立适合自身情况的指标参数。图2 裂解不同时间样品（A:25min B:10min）的全血细胞分群图）
2.4 在实验过程中进一步发现，温度对孵育和裂解的影响也较明显，一般在室温（25℃左右）孵育和裂解效果较好，温度较低（如10℃左右）会使孵育和裂解时间延长，抗原抗体结合不完全和红细胞裂解不完全。另外需要注意的是孵育时间，较短会使抗原抗体反应不充分，使得结果偏低，而反应时间较长对结果没有明显影响。有相关文献认为孵育时 间为30min ［9，10］ 或45min，考虑到实验周期及效率因素，本实验认为孵育20min即可以得到较为满意的结果。
3 结论
综合分析实验结果表明，血液样品在4℃条件下，8天之内的检测结果（CD3 + 、CD4 + 和CD8 + 细胞值）是可信的，处理固定后可保存更长时间（30天内结果有意义）。对血液样品保存时间的测定，本实验在较长时间内多次采集样品，并通过精密的实验安排和严谨的操作，本实验认为此结论可信。不过这个结论目前只局限于流式细胞仪对全血T-淋巴细胞亚群的检测，至于其它样品或指标，情况可能有所不同，这些有待于进一步的研究。
参考文献
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作者单位:510515广州第一军医大学中心实验室