点击显示 收起
关键词 未成熟 体外成熟 妊娠
In vitro maturation/fertilization of oocytes and embryo transfer in unstimulated cycles and mild stimulated cycles in polycystic ovarian syndrome patients
Li Yuan，Chen Zijiang，Zhao Lixin，et al.
Reproductive Medical Center of Shandong University and Shandong Provincial Hosptial，Jinan，250021.
【Abstract】 Objective Compared the results of in vitro maturation and fertilization of oocytes retrieved in unˉstimulated cycles and mild stimulated cycles.Methods In mild stimulated cycles，the patients were given150IU/d HMG for4to5days until the promoting follicle diameter eached10to12mm，then36th after10000IU HCG was givˉen，the oocytes retrieval would be performed.In unstimulated cycles，the patients would be given HCG on day10to12based on the ultrasound observation that no follicles larger than8mm.The immature oocytes were cultured and fertilˉized，the resulted embryos were transferred back to the females’uterus.Compare the results of in vitro maturation and fertilization，and the clinical pregnant results were also compared.Results One hundred eighty-two in vitro maturaˉtion cycles were performed on125patients，88were primed with little amount of Gn and other94cycles wwere not.The age，duration of infertility and basal endocrin
ology were have no difference between these two groups.In natural cycels，the maturation rate was significantly lower than Gn-priming group（65.3%and72.7%，P<0.05，but there was no difference between them in fertilization rate，cleavage rate and high quality embryo rate（P>0.05）.In Gn-priming cycles，embryos were transferred back to uterus in37patients，but only1got pregnant.In unstimulated cycles，75had embryos transferred and18were pregnant（24.0%），the implantation rate was6.0%.Conclusion Unstimuˉlated cycles are fit for in vitro maturation/in vitro fertilization and embryo transfer，the clinical pregnancy rate is similar to classical IVF/ICSI，but the implantation rate was too low.
Key words immature in vitro maturation pregnancy
严重的多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）引起的不孕是较难治疗的一种疾病。因为其引起不孕的原国主要是不排卵，但在用药物促排卵后极易发生卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS），即使是取卵做体外受精也不能完全避免OHSS的可能。因此，我们尝试在少量应用促性腺激素（Gonadotropin，Gn）周期和未刺激周期2种情况下，将PCOs患者的未成熟卵子取出体外，体外成熟培养（in vitro maturation，IVM）后受精，并进行胚胎移植，探讨这2种周期在治疗PCOS患者不孕症中的作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料 2001年6月～2003年6月，于山东省立医院生殖医学中心就诊的重度PCOs不孕患者，均达到以下标准 ［1］ :①月经稀发或闭经，伴或不伴肥胖、多毛等症状;②基础内分泌检查（月经周期第3天）显示睾酮（T 0 ）升高（>45ng/dl，化学发光法，BECKMAN公司），促黄体生成素/促卵泡激素（LH/FSH）≥2;③阴道B超检查发现每侧卵巢中直径2～8mm的卵泡≥15个。
1.2 治疗方法 随机将患者分为2组，Ⅰ组应用少量Gn刺激后取未成熟卵，Ⅱ组在未刺激周期取未成熟卵。
1.2.1 取卵周期的准备 Ⅰ组于黄体酮撤退月经周期第3天抽外周血进行基础内分泌测定，第5天行阴道B超监测。如果双侧卵巢中无直径>8mm的卵泡，即开始用人类尿促性腺激素（HMG）150IU肌肉注射，约4～5天，进行B超监测，如果发现双侧卵巢最大卵泡直径达10～12mm时，给予HCG10000IU肌注。36h后在异丙酚静脉麻醉下行经阴道超声下取卵术。Ⅱ组于黄体酮撤退月经周期第3天抽外周血进行基础内分泌测定，第10～12天行超声监测，如果双侧卵巢中无直径>8mm的卵泡，即肌注人类绒毛膜促性腺激素（HCG）10000IU，36h后行经阴道超声下未成熟卵取卵术。采用COOK公司生产的K-OPS-WOOD-1235穿刺针，抽吸负压为7.5kPa。
1.2.2 未成熟卵体外成熟培养/体外受精-胚胎培养 取出的卵泡液在保温条件下立即送入细胞培养实验室，在体视显微镜下将含有卵子的粘液团挑选出来，并在倒置显微镜下进行卵子形态和成熟情况的评价。如果卵细胞浆内见生发泡（germinal vesical，GV），无极体，为GV期卵;如无GV，又无极体，为第一次减数分裂中期（metaphaseI，MI）的卵。然后移入含10%胎牛血清、0.29mM丙酮酸钠、0.075IU FSH（Gonal-F，Serono公司）、0.15IU HCG（Profasi，Serono公司）和10ng/ml表皮生长因子（EGF，Sigma公司）的TCM-199中，并放入37℃、5%CO 2 培养箱培养。
培养28h～30h后去除颗粒细胞，在倒置显微镜下观察，评价其成熟情况，如卵子出现第一极体，即成为第二次减数分裂中期（metaphaseⅡ，MⅡ）期卵子，就认为其已经成熟。然后进行卵母细胞浆内单精子注射进行授精。16～18h后确认卵子细胞浆内是否出现双原核（即正常受精），并将正常受精卵移入胚胎培养液中过夜培养。24～30h后，在倒置显微镜下确认胚胎发育情况并进行胚胎评价，然后进行胚胎子宫腔内移植。优质胚胎是指卵裂球均匀，无核碎片不超过15%的胚胎。
1.2.3 子宫内膜的准备和妊娠的确立 注射HCG日观察子宫内膜厚度，如≥4mm，在取卵日开始给予17β-雌二醇6mg/d;如<4mm，则给予8mg/d。第2天肌注黄体酮60mg，第3天开始80mg/d，直至孕3个月，或于移植后14d检查未妊娠则停药。胚胎移植后14d检查血β-HCG，确定是否生化妊娠。移植32d行B超检查，如发现胎芽和原始心管搏动，确定系临床妊娠。
1.3 统计学方法 采用SPSS11.0软件进行数据分析。
2 结果
2.1 患者情况 共125例患者，进行IVM取卵182个周期，患者基本情况见表1，可见2组患者的年龄、不孕年限及基础内分泌情况相比没有明显差异。
2.2 不同取卵周期对卵子发育潜能的影响 将2组患者IVM周期中取得的卵子培养及受精结果进行比较，发现在未刺激周期中，卵子的体外成熟率明显低于应用少量Gn组，受精率、卵裂率和优质胚胎率2者差别不大。结果见表2。2.3 IVM/IVF-ET的临床结果 在应用少量Gn周期中，最初进行的37个胚胎移植周期中，仅获得1例临床妊娠和1例生化妊娠。由于妊娠率太低，以后的应用少量促性腺激素周期组患者放弃了行胚胎移植，而是将胚胎进行冷冻 保存，在今后周期中移植。
表1 2组患者情况的比较（略）
注:组间数据比较，P>0.05
表2 不同周期进行IVM结果比较少量应用Gn （略）
注:与少量应用Gn周期组相比较， ˇ P<0.05
在未刺激周期进行的IVM-ET，共70例患者，年龄26～31岁，平均28.2±3.2岁，不孕年限2～5年（平均3.9±2.7年）。进行IVM取卵94个周期，移植75个周期（78.7%），其余周期因为取卵数过少，或卵子成熟发育欠佳，或无足够的优质胚胎而放弃胚胎移植。每个取卵周期可获得6～38个卵子，共1283个，平均获卵数13.6个/周期。18例获得临床妊娠，其中16例单胎，2例双胎，妊娠率为24.0%，胚胎着床率为6.0%（见表3）。
表3 未刺激周期IVM-ET的临床结果（略）
3 讨论
3.1 IVM的意义 Trounson等 ［2］ 初次将IVM技术应用于PCOs患者，并且出生了健康的婴儿。IVM技术可以在不使用或仅少量使用Gn的情况下取得卵子进行IVM/IVF-ET，因此对于有雌激素依赖性疾病史的不孕患者比较适宜;因其特殊的内分泌环境，多囊卵巢综合征患者比其他患者更易发生卵巢过度刺激（OHSS），由于Gn用量小，IVM治疗中雌激素尚未上升到导致OHSS的水平，因此可以有效预防OHSS的同时解决PCOs患者的不孕问题;IVM可取得未成熟卵母细胞，此时尚未形成纺锤体，可以避免冷冻对卵子纺锤体的损伤，可能是将来解决卵子冷冻保存难题的途径之一。因此IVM技术的发展具有广阔的前景。
3.2 IVM目前存在的问题 目前IVM的结果还不能令人满意，还未能广泛的应用于临床治疗。主要原因是:（1）体外成熟率低:本实验室在常规ICSI周期中发现，卵子体内的成熟率是92%，而IVM的成熟率只有70%～85%，可能与培养系统（包括培养液、培养箱内气体和温度等因素）还不完善，不能更好的适应卵子体外成熟所需要的条件有关。（2）体外成熟后卵的受精率及卵裂率偏低，多精受精率增高，胚胎质量差:体内成熟卵的受精率可达70%～90%，而体外成熟的卵仅有60%～70%，且卵裂率低，胎胎质量较差，可能与细胞核、细胞质不能同步成熟有关，虽然我们看到了第一极体的释放，认为卵子已经成熟，但这只是细胞核成熟的标志，细胞质与细胞核不能同步成熟，就没有为受精及卵裂作好准备，也就得不到优质胚胎 ［2］ 。在培养过程中，卵子的透明带发生改变，皮质颗粒如果提前释放，会使受精受到阻碍;如果没有按时释放，则不能阻止后来的精子进入，形成多精受精;另外，细胞质成熟过程中活化的线粒体未能移至细胞中央导致第二次减数分裂时第二极体不能排出;微管系统损伤致使减数分裂进行异常而形成多核等都可能使多精受精率增加。（3）胚胎移植后妊娠率低:IVM的临床妊娠率只有10%～30%，与上述原因可能都有关系。3.3 不同取卵周期对于IVM/IVF结果的影响 将未刺激周期IVM的结果与少量应用HMG后再取未成熟卵进行IVM相比较发现，前者卵子的成熟率和优质胚胎率低于后者，受精率、卵裂率没有明显差别。分析原因可能与提前应用少量HMG，使卵子在体内先完成了一定程度的成熟，卵子的细胞质成熟程度好于自然周期者，所以，得到的优质胚胎比较多有关。因此，细胞质成熟的积累，直接影响到卵子受精后发育潜能，进而影响到患者的妊娠结局。但是由于在应用少量促性腺激素周期中，可能因为子宫内膜的准备方案不适合胚胎着床，所以没有获得满意的临床妊娠率，不 能有效的应用于临床患者的不孕治疗。另外，以往有报道认为从刺激和未刺激周期中获得的未成熟卵获得成熟的时间不
同 ［3］ ，但我们前后进行体外成熟培养的时间是相同的，因此这也可能是得到的结果不同的原因之一。
因为在未刺激周期获取多囊卵巢中存在的小卵泡存在一定的技术难度，所以取卵技术成为决定IVM结局的决定性因素之一。Russell ［4］ 报道对于未刺激的PCOs患者的平均获卵数为11.7，Trounson ［5］ 报道的为15.3，与本文（13.6个）相类似，说明在超声下从未刺激的卵巢中取未成熟卵是可行的，而且本文及以往的研究均未发现因为取卵术造成如出血、感染等严重并发症者。在未用静脉麻醉取卵前，患者的疼痛感明显强于传统的IVF取卵，在应用麻醉后，患者基本无不适感，接受性得到提高。在我们中心进行的静脉麻醉对IVF/ICSI结果的影响的研究中，发现静脉注射异丙酚麻醉不会影响卵子和胚胎的质量。但是否会影响IVM的结局有待进一步研究。
在移植IVM得到的胚胎前，需要进行子宫内膜的准备。适宜的子宫内膜准备是决定能否获得妊娠的关键之一。有在用HCG前就开始内膜的准备者 ［4］ ，也有在取卵后才进行内膜准备者 ［6～7］ 。但大多数研究均在取卵后开始内膜的准备，因此本文采用的就是该方法。胚胎的着床率为6.0%，略低于前者（分别为8.9%和6.9%）。比较其差别，主要是未成熟卵进行体外成熟培养的时间不同，本研究是28～32h，而其他研究为48h。可能是延长的体外培养时间使卵子的细胞质得到进一步的成熟，为今后胚胎的发育奠定了良好的基础，因此胚胎的发育潜能较好，着床率较高。今后，我们也会尝试延长体外培养时间，观察其效果。
参考文献
1 曹泽毅.中华妇产科学，北京:人民卫生出版社，1999，2176.
2 Trounson A，Wood C，Kausche A.In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recoverd from untreated polyˉcystic ovarian patients.Fertil Steril，1994，62（2）:353-362.
3 Cha KY，Chian RC.Maturation in vitro of immature human oocytes for clinical use.Hum Reprod Update，1998，4:103-120.
4 Russell JB，Knezevich KM，Fabian JA.Unstimulated immature oocyte reˉtrieval:early versus midfollicular endometrial priming.Fertil Steril，1997，67:616-620.
5 Trounson A，Wood C，Kausche A.In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polyˉcystic ovarian patients.Fertil Steril，1994，62:353-362.
6 Cha KY，Han SY，Chung HM，et al.Pregnancies and deliveries after in vitro maturation culture followed by in vitro fertilization and embryo transfer without stimulation in women with polycystic ovary syndrome.Fertil Steril，2000，73（5）
:978-983.
7 Child TJ，Ahmad MRCOG，Gulekli B，et al.In vitro maturation and ferˉtilization of oocytes from unstimulated noemal ovaries，polycustic ovaries，and women with polycustic ovary syndrome.Fertil Steril，2001，76:936-942.
作者单位:250021山东大学山东省立医院生殖医学中心