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1 结构和特征
结构性染色体脆性位点（common frigal of sites;CFSs）在所有的真核细胞中发现，是染色体的一个基本特征，近80%的结构性脆性位点已经被描述，常见的是FRA3B（3p14.2）和FRA16D（16q23.3-q24.1），较少见的是FRA6E（6q26），FRA7H（7q32）和FRAXB（Xp22）。WWOX基因位于人类普通的染色体脆性位点，跨越1，113，822bp大小的巨大基因组区域，包含FRA16D（16q23.3-q24.1），跨越微卫星体标记D16S515-D16S504，由9个外显子组成，其外显子本身的编码并不大，但其内含子5和8非常大。仅内含子8就有779，639bp ［1，2］ 。用细菌和酵母的人工染色体探针杂交鼠中期染色体，证实鼠Woxl定位于Fra8E1，与鼠Fra8ei/WWOX高度保守的序列同源，且保守性不仅限于基因的编码区域，在一段长内含子区域也是如此，至少有100-kb的区域高度保守 ［3］ 。Bednarek等用鸟枪法测定FRA16D（16q23.3-q24.1）区域的序列，接近400，000bp，包合GeneBank已报道了的一个100，000bp长的连续序列（accesˉsion No.AF179633），包含唯一的外显子—内含子结构的cDˉNA，克隆出完整的cDNA和特征性的候选基因—WWOX ［4］ 。WWOX编码一个含414个氨基酸的蛋白，含有两个限制性蛋白域，其氨基末端的88个氨基酸与WW域蛋白家族高度保守的序列同源，羧基末端的326个氨基酸与脱氢酶/还原酶（SDR）的短链同源，故命名为包含氧化还原酶的WW域（WW domain-containing oxidoreductase，WWOX）［4，5］ 。Christina ［6］ 等用新的序列预测和取样方法确定WW域包含小的β片层基序。WW基序参与蛋白-蛋白相互作用，其本质是传递信号转导信息，只有少数的蛋白—蛋白识别域分子。富脯氨酸的基序是常见的蛋白—蛋白相互作用的目标，可能是其独特结构适合这一区域。识别富脯氨酸的区域包括SH3，EVH1和WW域，包含35～45个氨基酸长的高度紧密的WW域，以出现成对的保守色氨酸（即W）为特征。这两个W残基“信号”间隔大约20-22氨基酸，是域结构和功能的基础。WW域识别含脯氨酸的序列，有非常多变的序列选择趋向，组成四组基本的WW域。GroupⅠ和GroupⅡ是主要的和更常见的。GroupⅢ和GroupⅣ较少见。GroupⅠ结合与Pro-Pro-X-Tyr（PPXT）一致的最小核心。标准的含WW域GroupⅠ的蛋白包括YAP65，dysˉtrophin和NEDD4。含特殊的富脯氨酸基序蛋白组成的特殊配体，如dystrophim WW域的配体是β-distroglycan，包含PPXY基序。含GroupⅡWW域的蛋白包括formin结合蛋白和FE65，结合Pro-Pro-Leu-Pro（PPLP）基序，GruopⅢWW域以Arg或Lys从侧面接于聚脯氨酸基序，GroupⅣWW域倾向于含磷酸-Ser-Pro-，或磷酸-Thr-Pro的配基。含GroupⅣ的典型蛋白是Pin-1。这个蛋白经过像cdc25c磷酸酶这样的有丝分裂特异的磷酸化蛋白调节有丝分裂早期事件 ［6～8］ 。
WWOX中心含有与SDR酶家族高度同源性的区域。基于WWOX在激素调节组织中高表达（在人睾丸、前列腺和卵巢中）和其氨基酸序列与特异的氧化还原酶同源的认识，WWOX可能是一个参与性激素新陈代谢的酶 ［3］ 。Kallˉberg ［9］ 等分析了人SDRs酶的结构，人体中有63种不同的SDR酶，剔除可能的异构酶，真正的SDR酶有58种。其中，46种是经典型的，17种是扩展型的（与糖代谢最相关）。WWOX结构是经典的SDRs四个独立簇的原型代表之一，其余三个簇的代表分别是人Hep27，FVT1和17β-HSD3。目前只有17β-HSD3的分子功能被鉴定出来（参与组织特异的睾丸激素的合成），其余三个决定簇的代表者WWOX、Hep27和FVT1均与肿瘤的发生有某些联系。Hep27是从肝细胞癌中克隆出来的蛋白，是与生长相关的核蛋白。FVT1则是作为非霍杰金淋巴瘤的转位靶基因而被鉴定出来的，在某些T细胞恶性淋巴瘤中过度表达，表明了其在肿瘤发生过程中的作用。Kallberg等认为WWOX与性激素新陈代谢有关，不仅是根据其组织分布和结构特征，而且根据在WWOXs决定簇中发现的两个其他的SDRs:CGI-82和PAN2。CGI-82在前列腺中有丰富的表达 ［10］ ，PAN2与其他的羟基类固醇脱氢酶序列相似［9］ 。
2 作用机制
WWOX的亚细胞位点在Golgi（高尔基）体和线粒体。临时表达一个融合全长WWOX的GFP（green fluorescence protein，绿色荧光蛋白），用共聚焦显微镜可清楚地看见绿色荧光，而用两个特异拼接的转录子编码的蛋白（dlta6-8和dlta5-8）融合GFP，显示出专有的核内荧光 ［8］ 。全长WWOX定位于Golgi体，而异常拼接的转录子编码的蛋白定位于核内，推测SDR域内部的氨基酸参与引导WWOX到Golgi体，位于209-273号氨基酸之间的65个氨基酸残基序列是线粒体的目标信号 ［11］ 。用Golgi特异标记的GFP-WWOX（Golgi58k蛋白）显色，在线粒体可观察到WWOX和p53的蛋白复合体。仅用Golgi体特异的标记物而非其他细胞器的特异标记物显色，表达GFP-WWOX融合蛋白的细胞清楚地在核外显示绿色荧光。为更精确地定义WWOX在Golgi中的靶序列，Bednarek ［8］ 等用位点导向的剔除SDR域而未剔除WW域的突变体:突变体dlta5-7，剔除了外显子5、6、7，使基因内部的外显子1-4融合到外显子8和9;突变体dlta8剔除了外显子8，使外显子1-7融合到外显子9内部。表达两突变体之一的细胞显示出除核仁外的胞浆和核的混合荧光，表明亚细胞位点因SDR域的破坏而受影响。全长WWOX蛋白的信号氨基酸的改变是恰当的亚细胞位点定位所必需的。用一个单独剔除WW域的SDR-GFP融合蛋白，检测到这些突变体在核周的荧光与全长的WWOX相似，WWOX delta结构编码的预期蛋白的共同特征是全长蛋白酶活性区域的缺失而保留了WW域。在鼠WWOX蛋白的两个WW域之间已鉴定出一个核内信号 ［11］ 。研究结果未能研究WWOX亚细胞定位的氨基酸序列，但确定了SDR域是Glogi定位所必需的。最近，一个果蝇基因Salvador被克隆，编码一个含两个WW域的蛋白，参与细胞周期的调节和介导凋亡。最重要的是，人的同源基因Salˉvador（SAV1）在三个肿瘤细胞系中出现突变，提供了含WW域的蛋白与肿瘤相关的其他证据 ［12］ 。
在正常细胞和肿瘤细胞中已检测到WWOX的转录变体。全长的WWOX mRNA（转录变体1）仅在正常组织中表达，编码包含WW域和SDR域的全长WWOX蛋白。在肿瘤中最常见的转录体表达是全长的WWOX mRNA和四个异常的mRNA拼接（转录变体2-4）。在多种肿瘤细胞系中，如MM细胞系和原发性乳腺肿瘤中，同时发现伴随外显子6-8和5-8的WWOX转录的异常拼接（转录变体3和4），随后观察到存在其他的转录异常（转录变体2和5） ［13］ 。有意义的是这些转录变体结构在正常组织中未检测到 ［13，14］ 。用异常拼接的新的外显子-外显子连接的特异引物，检测到近33%的原发性乳腺癌表达异常的delta6-8WWOX mRNA结构（转录变体3） ［8］ 。多个研究组在肿瘤标本中发现共同表达的WWOX异常拼接结构，尤其在乳腺、卵巢和食管癌中。发现在乳腺癌细胞中发生转录物的异常拼接，而没有WWOX外显子的缺乏。因此，WWOX异常结构可以是经WWOX mRNA的异常拼接，也可以是WWOX等位基因的外显子缺失 ［4，13，15］ 。其表达的缺失并非由于DNA甲基化导致的转录沉默，而可能是调节WWOX启动子的转录活性发生了改变。Paige等研究证实WWOX在卵巢癌细胞系和其他肿瘤细胞系中纯合性缺失，这些缺失的基因敲除了WWOX编码的酶的一部分，从而影响肿瘤细胞的生长 ［4］ 。Kuroki等在1例食管癌中观察到WWOX LOH被突变体补充，突变的结果是291号氨基酸的亮氨酸被脯氨酸替代。虽然这一突变对WWOX功能的影响尚未知，但让人注意到这一氨基酸最接受预测的SDR活性位点，可能影响其接触反应的活性 ［15］ 。
Chang等发现线粒体的WWOX可能参与p53在线粒体启动细胞凋亡的分子途径，而且增加肿瘤细胞对肿瘤坏死因子（TNF，tumor necrosis factor）细胞毒的敏感性，其增强作用是通过显著下调凋亡抑制者Bcl-2和Bcl-xL，但上调促凋亡者p53的表达 ［11］ 。WWOX的缺失和变异可能抑制凋亡，促进肿瘤的发生和发展。
由于细胞扩增的增加或其他未知的拼接机制上的异常，拼接异常经常发生在肿瘤中，同时，拼接异常可能更常影响有长转录产物的基因，像WWOX一样。WWOX异常拼接的转录体可能是非功能性的mRNA。转录变体2WWOX mRNA的序列已被详述，其1/8的外显子叠加在两个改变了的外显子9’和10。这个转录体编码的蛋白与转录变体1的全长WWOX编码的蛋白一样，包含WW域和一个完整的SDR域，但羧基末端的氨基酸顺序有差异 ［14］ 。
3 与肿瘤的发生及进展的关系
关于染色体的脆性位点有一种假说:脆性位点预先安排染色体突变，使高度重组的序列发生重排，这种结构改变了可变区域可以在肿瘤中发现。常见的脆性位点影响这些染色体区域的功能基因编码，使其改变或失活，在肿瘤的发展或进展中起重要作用。然而，关于这些失常的共同脆性位点和其管家基因在肿瘤进展中的影响是原因还是结果仍存在疑问。有人认为这些失常基因可能影响基因驻留区域，使染色体重排而产生的结果，而不是基因失活与肿瘤的起源相关，共同脆性位点区域的基因可能仅仅是一个无辜的“旁观者”。Bednarek ［8］等认为位于脆性位点区域的WWOX通过基因组重排，启动肿瘤的发生和进展，而在肿瘤进展中作用可能比启动更重要。
大多数乳腺癌细胞系和原发肿瘤中检测到WWOX的纯合性缺失，其多数的缺失在基因的内含子区域。检测细胞系的杂合性缺失时，未能在余留的等位基因的外显子编码中发现任何突变，在WWOX编码区域检测到一系列被杂合化的基因多态性。用Northen和RT-PCR的方法检测，乳腺癌细胞系中有不同水平的WWOX表达，有些不表达，而另外的过度表达 ［3］ 。Bednarek ［8］ 等已生产了WWOX特异的抗血清，用于检测正常细胞和癌细胞中WWOX蛋白水平。抗血清是用包含12-94号WWOX氨基酸残基，其含两个WW域，融合入GST（GST，glutathione S-transferase谷胱甘肽-s基转移酶）。用WWOX表达的载体导入Peo细胞（一个卵巢癌细胞系），产生一个Peo/WWOX细胞系，作为WWOX蛋白表达的阳性对照，以Peo/Vertor为阴性对照，在细胞系的全部抽提物的Western Blotting检测证实，预期～46kD大小的WWOX蛋白在阳性对照中清楚地显示出来，而在阴性对照中缺乏 ［8］。
目前已用抗血清测定癌细胞系和正常组织中的WWOX蛋白水平。检测结果，WWOX蛋白水平和先前用Northern及Real time PCR分析的WWOX在这些细胞系中的表达情况非常相符 ［3，8］ 。WWOX表达与细胞系的恶性程度呈负相关。在高侵袭性的细胞系如MDA-MB-231和MDA-MB-435中WWOX低表达或基本检测不到，而低侵袭性的系如MCF7和T47D相对高表达。同样，WWOX表达与细胞系中的ER状态有良好的相关性。表达高水平WWOX的细胞系MCF7和T47D ER阳性，而仅低水平表达WWOX的MDA-MB-231和MDA-MB-435，ER阴性 ［8］ 。虽然在高恶性的乳腺癌细胞系MDA-MB-435有WWOX等位基因的半合子，但WWOX mRNA和蛋白的表达几乎检测不到。其表达的缺乏不是由于基因的甲基化现象，因为用CpG甲基化抑制剂5-aza-2’-脱氧胞嘧啶处理表达没有增加，用重亚硫酸盐DNA测序的多种细胞系中，CpG岛周围的启动子和WWOX的第一个外显子也没有发现任何甲基化的征象 ［8］ 。
明显地，WWOX基因是一个常见的基因组不稳定的目标，在多种肿瘤中影响其表达，是一个潜在的肿瘤生长的抑制者。Bednarek等在体内检则WWOX表达水平对高恶性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-435）的肿瘤生长的影响，WWOX低水平表达或基本检测不到。稳定表达WWOX的细胞系注入裸鼠的乳腺脂肪垫，观察35天，结果表明WWOX表达的细胞系显示出比载体对照的细胞系更显著的对肿瘤生长的影响;而异常的WWOX表达强烈的抑制在软琼脂上生长的乳腺癌细胞系MDA-MB-435和T47D的锚定。经遗传修饰的WWOX等位基因大鼠模型更能清楚地显示WWOX在肿瘤起源中可能扮演的角色 ［8，18］ 。Yendamuri ［16］ 等用RT-PCR分析27对正常肺组织和肺癌及8个肺癌细胞系的WWOX的杂合性缺失和突变，WWOX外显子错误转录在7个（7/27;25.9%）原发性肿瘤中的5/8的细胞系中检测到，WWOX位点的杂合性缺失为37.0%（10/27），认为WWOX的改变参与了非小细胞肺癌的发病。Ishii ［17］ 等在造血系统恶性肿瘤中检测了WWOX和FHIT的表达，结果有相似发现。WWOX转录子失常或缺失在51%的病例和55%的细胞系中检测到，3个WWOX的核苷酸变体在白血病细胞系中出现，DNA blot研究显示在急性白血病中2/18WWOX基因缺失，2例未表达。Ludes-Meyers ［18］ 等认为确定WWOX基因是肿瘤抑制基因的理由如下:（1）WWOX基因图谱在人类肿瘤中显示出区域的杂合性缺失（LOH）和纯合性缺失;（2）联合cDNA选择、外显子捕获和从人类基因组序列草图预测在这一700-kb区域没有其他的基因;（3）鼠的WOX1基因直接与p53结合，增强TNF-α介导的细胞死亡，推测人WWOX蛋白显著地调节凋亡;（4）实验证实在原发性卵巢癌细胞和其他的3个细胞系中WWOX外显子的纯合性缺失。在两个卵巢肿瘤和胰腺癌细胞系的缺失起因于移码突变，而在两个细胞肺癌细胞系中出现结构内标的缺失。每一个的异常基因的ADH（乙醇还原酶，SDR家族酶之一）区域被破坏，线粒体信号位点和底物结合位点缺失，使蛋白失活。
然而，新近有研究者对WWOX基本作为肿瘤抑制基因的角色提出相反的见解。Watanabe ［19］ 等用单克隆抗体分析WWOX的表达，用免疫印迹法检测49个肿瘤细胞系，虽然一些细胞系出现异常的WWOX RNA转录，但仅正常结构的蛋白可检测到。用MG-132抑制蛋白酶的降解显示出短截蛋白的集聚，而正常蛋白的表达水平没有改变，推测短截蛋白可能通过蛋白酶的机制快速降解。肿瘤细胞的免疫组化证实，WWOX蛋白水平没有减少，反而在胃和乳腺肿瘤中增加，从而对WWOX作为一种经典的肿瘤抑制基因的观点提出挑战。在非肿瘤细胞，WWOX仅在表皮细胞中观察到，包括激素调节细胞如Leydig细胞、滤泡细胞、前列腺上皮和乳腺腺体。因此，WWOX作为候选抑癌的地位还存在争议，就像在FHIT基因中的争议一样。
4 展望
WW域和其蛋白-蛋白相互作用机制正在成为一个新的热点，WWOX在上游基因和下游基因受到研究者的广泛关注，WWOX蛋白和p53形成的蛋白复合体，抑制凋亡的发生，可能是肿瘤发生的途径之一。脆性位点的异常转录及其基因组的不稳定性是肿瘤发生的原因还是结果 ［20］ ，是尚要解决的问题，而最终要确定的是异常拼接的转录物是否编码蛋白结构，因此，需要发展识别抗原决定簇内部的WW域的抗-WWOX抗体，检测异常拼接mRNA编码的蛋白，了解其在各种肿瘤中的表达水平，确定其抑癌基因的地位。将来研究的焦点将集中再WWOX mRNA及其表达蛋白在肿瘤发生、进展中的改变情况。
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作者单位:200000上海市长海医院肿瘤科