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首页合作平台在线期刊中华实用医药杂志2004年第4卷第18期论著

氧化低密度脂蛋白对血管内皮细胞中新的第二信使内源性一氧化碳及其合成酶作用研究

来源:中华实用医药杂志
摘要:【摘要】目的研究致动脉粥样硬化危险因素———氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)与新的第二信使内源性一氧化碳(CO)及其合成酶血红素氧化酶-1(HO-1)的相互作用。方法通过反转录聚合酶链式反应、mRNA表达图像分析方法、放免法及生物化学等多项指标观察OX-LDL对培养血管内皮细胞中新的第二信使CO及其合成酶HO-1的作......

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        【摘要】 目的  研究致动脉粥样硬化危险因素———氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)与新的第二信使内源性一氧化碳(CO)及其合成酶血红素氧化酶-1(HO-1)的相互作用。 方法  通过反转录聚合酶链式反应、mRNA表达图像分析方法、放免法及生物化学等多项指标观察OX-LDL对培养血管内皮细胞中新的第二信使CO及其合成酶HO-1的作用。 结果  OX-LDL能刺激培养血管内皮细胞HO-1mRNA的表达及CO含量的增高,也能刺激内皮细胞ET-1mRNA表达增高。但加入氯化高铁血红素后,HO-1mRNA的表达增高,产生更多的CO及cGMP,从而导致ET-1mRNA表达减低。 结论  增强HO-1mRNA的表达及CO含量能降低由OX-LDL诱导的作用最强的血管收缩肽ET-1mRNA的表达。

     关键词  血红素氧化酶-1 内源性一氧化碳 氧化低密度脂蛋白

     The research of the interaction of OX-LDL with heme

     oxygenase-1in culture vascular endothelial cell

      Yu Lu

      Department of Kidney,305Hospital of People Liberation Army,Beijing100017.   

  【Abstract】 Objective To research the interaction of the risk factor of guiding atherosclerosis-OX-LDL with the new second message-endogenous carbon monoxide and his synzyme heme oxygenase-.Methods Reverse transcription-polymerse chain reaction,dot blot and some biochemical index arks were performed so as to research the interaction of OX-LDL with endogenous carbon monoxide and his synzyme heme oxygenase-1.Results OX-LDL can incite the express of heme oxygenase-1mRNA and increase the concentration of endogenous carbon monox-ide and incite the express of ET-mRNA.After adding hemin,there are remarkable increase of the express of hene oxygenase-mRNA,heightening the concentration of endogenous carbon monoxide and cGMP.It would reduce the express of ET-1mRNA.Conclusion Heightening the express of heme oxygenase-1mRNA and the concentration of endogenous carbon monoxide can reduce the express of ET-1mRNA.


     Key words heme oxygenase-1 endogenous carbon monoxide OX-LDL

       近年来研究发现内源性一氧化碳(CO)是一种新型的信使分子,作为CO的限速酶和关键酶,即血红素氧化酶(HO)已被证实几乎分布于所有器官和组织。我们在以往的实验中已发现在动脉粥样硬化发展过程中,主动脉与冠状动脉的内皮细胞中CO与HO-1mRNA明显增加,而且胆固醇摄入时间越长、量越大,则其含量增加越明显 [1] 。

  说明CO与HO-1mRNA在整体动物动脉粥样硬化发病中有明显作用。在此基础上本研究选择了对实验研究更精确、可控性更强的内皮细胞培养技术及致动脉粥样硬化危险因子———氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)对培养血管内皮细胞进行刺激,以便确定OX-LDL与CO与HO-1在动脉粥样硬化发病中的可能机制。

   1 材料和方法

     1.1 人脐带静脉内皮细胞的体外原代培养及鉴定方法

   1.1.1 人脐带静脉内皮细胞的体外原代培养方法 取健康产妇分娩3h内的脐带按常规方法用胰蛋白酶分离脐静脉内皮细胞。置37℃细胞培养箱内培养,每2~3天换液1 次


    1.1.2 体外培养血管内皮细胞鉴定 (1)在倒置显微镜下直接观察细胞形态和生长特点。(2)第Ⅷ因子相关抗原(FⅧR)免疫组织化学染色(PAP法)。

 1.2 实验分组

    1.2.1 对照组 培养72h的人脐带静脉内皮细胞。

    1.2.2 OX-LDL处理组 即在培养72h的人脐带静脉内皮细胞中加入100μg pr/ml OX-LDL后6h的培养的脐带静脉内皮细胞。

    1.2.3 OX-LDL+Hemin(氯化高铁血红素)组 即在培养72h的人脐带静脉内皮细胞中加入100μg pr/ml OX-LDL后6h的培养的脐带静脉内皮细胞中,分别再加入Hemin5μM6h、12h的培养的脐带静脉内皮细胞。

    1.3 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定培养血管内皮细胞mRNA表达 [2]  按宝灵曼公司的总RNA纯化试剂盒方法分别提取各组培养细胞的RNA。RT-PCR:采用随机引物法,RT-PCR试剂盒(Boehringer Mannheim)。

 聚合酶链式反应扩增HO-1和β-肌动蛋白(β-actin)特异性片段。扩增HO-1cDNA特异性片段的引物是根据Toshisuke发表的HO-1特异性引物的序列 [3] 确定的。上游引物为5′-GAATTCAGCATGCCCCAGGATGGT-3′,下游引物为5′-CTAGACTAGCTGGATGTTGAGCAGGA-3′。在进行RT-PCR的同时扩增鼠β-actin用作内参照,保证每次实验的相对可比性,扩增鼠β-actin特异性片段的上游引物为5′-CGGGA AAT CGT GCT ACA TT-3′,下游引物为5′-GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′。按常规方法进行PCR,94℃1min,50℃1min,72℃1min。首轮循环95℃2min,最后72℃延伸5min,共进行30次循环。然后进行1%琼脂糖电泳分析。

    1.4 培养血管内皮细胞HO活性变化研究 分别取各组培养细胞测HO活性,空白管为正常培养基。将细胞悬浮于缓冲液中。离心后将上清加入反应混合液中,按文献方法 [3] 测定HO活性。根据在464nm和530nm处的光吸收度推算出,胆红素的消光系数为401/mmol/Lcm。蛋白定量采用考马斯亮蓝法。

    1.5 培养血管内皮细胞CO变化研究 按文献方法 [4] 测定CO活性。

    1.6 培养血管内皮细胞丙二醛(MDA)含量测定 按TBA荧光法测定细胞丙二醛(MDA)含量 [5] 。

    1.7 培养血管内皮细胞cGMP含量变化研究 [6]  cGMP测定按 125 I标记试剂盒说明书进行。

    1.8 培养内皮细胞ET-1mRNA的斑点杂交及图像分析法 [7]  取适当的NC膜进行处理,再取保存的总RNA8μl,加变性稀释液。依次取各时相点总RNA、ET-1cDNA及血红素氧化酶-1cDNA质粒各2μl点样于NC膜小方格的中央,烤膜,65℃预杂交20h。后加入2.5ml杂交液中,置42℃杂交18~20h。多次漂洗后加地高辛抗体,使抗体1∶5000稀释,37℃,45rpm摇动30min。加新配制显色液,间断观察  显色情况。待显色满意后终止显色反应,拍照。图像分析: 测定各点积分光密度值。

    1.9 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示,采用Microsoft Excel97数据分析统计程序进行单因素方差分析及部分指标相关分析。

  2 结果

     2.1 倒置相差显微镜观察 血管内皮细胞4h内贴壁,24h左右形成集落,72h细胞生长迅速,集落明显增大。培养第7天细胞完全融合成连续的单层。

    2.2 FⅧR免疫组化染色 应用FⅧR抗血清免疫组化染色可见所有细胞浆中均有棕色阳性反应(图1)。

    2.3 RT-PCR法检测体外培养血管内皮细胞HO-1mR-NA变化 OX-LDL组HO-1mRNA的表达与对照组相比有所增加;而OX-LDL+Hemin6h组与对照组和单纯刺激组相比HO-1mRNA表达有非常明显增加;OX-LDL+Hemin12h组与加Hemin6h组相比HO-1mRNA的表达有非常明显增加。而β-actin mRNA的表达在各组之间表达量无明显变化。(P均<0.01)(图2)(见表1)。

    2.4 体外培养血管内皮细胞HO活性变化 培养血管内皮细胞的OX-LDL组HO的活性较对照组有非常明显增高;而OX-LDL+Hemin6h组HO活性比OX-LDL组有非常明显增高;OX-LDL+Hemin12h组HO活性比OX-LDL-Hemin6h组组有非常明显增高(P均<0.01)(见表1)。

  2.5 体外培养血管内皮细胞CO含量变化 培养血管内皮细胞OX-LDL组CO含量比对照组有非常明显的增高;OX-LDL+Hemin6h组CO含量比OX-LDL组有非常明显的增加;OX-LDL+Hemin12h组比OX-LDL+Hemin6h组有非常明显的增加,P均<0.01,相关分析表明:CO的浓度的增高与HO活性增高呈非常显著的正相关(r=0.981632,P<0.01),(见表1)。
     表1 内皮细胞HO-1mRNA表达图像分析、HO活力、CO含量变化 (略)  注:与前一时相点相比, # P<0.01,单位:CO(μg/mg)、HO酶活力(pmol bilirubin/mg.pr/h)

  2.6 体外培养血管内皮细胞MDA含量的变化 培养血管内皮细胞OX-LDL组比对照组MDA的含量非常明显的增高(P<0.01),OX-LDL+Hemin6h组比OX-LDL组的MDA的含量明显降低(P<0.01)。OX-LDL+Hemin12h组比OX-LDL+Hemin6h组的MDA的含量非常明显的降低(P<0.01),而与对照组相比:OX-LDL+Hemin12h组MDA仍非常显著地高于对照组,从以上结果来看OX-LDL能非常显著地增高培养内皮细胞MDA的含量,而在加入氯化高铁血红素后MDA的产生逐渐减少,表明氯化高铁血红素可能通过某种机制减少MDA的产生(见表2)。

     2.7 体外培养血管内皮细胞cGMP含量变化 培养血管内皮细胞OX-LDL组cGMP含量比对照组有明显的增高;OX-LDL+Hemin6h组cGMP含量比OX-LDL组有非常明    显的增加;OX-LDL+Hemin12h组比OX-LDL+Hemin6h     组有非常明显的增加,P均<0.01,相关分析表明:OX-LDL组cGMP含量的增高与内源性一氧化碳的浓度的增高呈显著的正相关(r=0.92259,P<0.05)(见表2)。

    2.8 体外培养血管内皮细胞ET-1mRNA表达量的变化 实验中观察到培养血管内皮细胞OX-LDL组ET-1mR-NA表达量比对照组ET-1mRNA的表达呈非常显著的增加,OX-DL+Hemin6h组比OX-LDL组的ET-1mRNA的表达呈非常显著的降低。而OX-DL+Hemin12h组与OX-LDL+Hemin6h组相比其ET-1mRNA的表达呈非常显著的降低(图3)。从以上结果来看OX-LDL能非常显著地增高培养内皮细胞ET-1mRNA的含量,而在加入Hemin后ET-1mRNA的表达逐渐减少,表明Hemin可能通过某种机制减少ET-1的产生(图3)(见表2)。 表2 内皮细胞MDA含量、cGMP含量变化、ET-1mRNA表达图像分析 略)          注:与前一时相点相比, # P<0.01,单位:cGMP含量(pmol/L)、MDA(nmol/mg.pr)

  3 讨论

     以往的研究表明CO是一种第二信使 [8] ,而作为血红素代谢中的限速酶HO-1,能降解血红素为胆绿素、铁离子和一氧化碳。H0-1在正常生理状态、机体应激及疾病状态中均发挥作用 [9] 。我们在动物实验通过免疫组化染色和原位杂交研究发现HO-1主要存在于血管的内皮细胞 [10] ,仅在动脉粥样硬化的晚期HO-1蛋白在血管平滑肌细胞出现阳性反应。并且发现随着主动脉壁和冠状动脉的内皮和内皮下动脉粥样硬化病变逐渐加重,HO-1的mRNA的表达和HO-1的蛋白表达呈动态进行性增强的发展趋势

  OX-LDL是在动脉粥样硬化的发展过程中的重要因素,起着促进粥样硬化发展的作用 11] 。我们研究观察到OX-LDL加入培养内皮细胞后能促使HO-1mRNA表达明显增高,HO-1活性也增高,并且OX-LDL的这种作用在将细胞用Hemin处理后,培养细胞HO-1mRNA表达增加更为显著。目前研究也发现亚铁血红素的降解产物胆绿素和胆红素是抗氧化剂,在哺乳动物中胆绿素是由胆绿素还原酶降解的 [12] 。以前的研究表明胆绿素和胆红素具有抑制亚油酸和LDL氧化的能力,其抗氧化的能力比α-生育酚要强 3] 。目前认为HO-1参与机体抗氧化损伤 [14] 。在动脉壁的内皮下OX-LDL的形成已确认为动脉粥样硬化的发病机制,OX-LDL也是动脉壁上自由基的主要来源 15] 。因此由OX-LDL诱导HO-1mRNA表达增高,从而导致胆绿素和胆红素增高,对机体产生抗氧化作用,这可能是机体的一种自我调节作用。我们的实验结果表明,在OX-LDL作用下,内皮细胞培养液中丙二醛浓度增高,而在Hemin刺激培养内皮细胞后,其浓度明显下降。我们认为无论从增强的HO-1反应所产生的或外源进入的胆绿素或胆红素均可作为抗氧化剂。最近有一些研究者报道在血浆中较高浓度的胆红素具有减低冠状动脉疾病发生的危险因素的作用 [16] 。在动脉粥样硬化中持续的氧化应激和细胞因子作用于血管壁导致机体抗氧化途径的增强,可能是机体自我调节的一种重要的自我保护的方式。

     我们在实验中发现OX-LDL能非常明显的增强培养血管内皮细胞ET-1mRNA的表达,而加入Hemin刺激后各组培养血管内皮细胞的HO-1mRNA表达、HO-1活性、cGMP的含量明显增高。同时培养内皮细胞的ET-1mRNA的表达逐渐降低。内皮素(ET)是目前所发现作用最强的血管收缩肽。我们在实验观察到OX-LDL能明显地刺激培养的血管内皮细胞ET-1的产生。20世纪90年代初Martin发现OX-LDL能刺激巨噬细胞分泌ET-1 [17] 。近年Achmad在研究内皮细胞对OX-LDL刺激的反应及其产物对单核细胞的迁移的作用中,也证实OX-LDL能非常明显地刺激培养的内皮细胞分泌ET-1。这与我们的研究结果
    是一致的。ET与心血管疾病的病理生理变化有密切的关 系。在动脉粥样硬化的发展过程中大鼠肠系膜动脉、主动脉及冠状动脉的内膜,发现ET-1mRNA表达增强。由于ET是机体在某些病理状态下产生和释放的一种重要的致病因子,因此抑制ET的产生可能达到治疗疾病的目的。我们在实验中观察到Hemin通过增高HO-1mRNA的表达,使CO产生增多,使cGMP的含量增高,降低由OX-LDL引起的ET的含量增高。Toshisuke也报道CO是cGMP的刺激物,cGMP增多抑制ET的产生 [18] 。这与我们的观察结果是一致的。
    因此我们认为HO-1及其产物CO和胆红素及胆绿素对动脉粥样硬化的发病均有某种抑制作用,能减缓动脉粥样硬化的发展。如果能采取一些方法增强HO-1mRNA的表达,从而使其及其产物能够延缓动脉粥样硬化的进展将更有意义。


     (本文图片见封三)

     参考文献

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    * 基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号:39800065)

    作者单位:100017北京解放军305医院肾脏暨血液净化中心

(编辑青 山)

作者: 喻 陆 2005-8-3
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