点击显示 收起
【摘要】 免疫组化在我国各医院已广泛开展，但多以说明书为基础操作规程，多厂家操作不一，抗体效价滴度不尽相同，技术水平参差不齐，开展项目多寡不一，判断标准各持一词，室内质控更是开展甚少，造成个别病理大夫对免疫组化结果批判地接受。介于目前情况，免疫组化室间质控及室间调查势在必行。室间质控及室间调查的基础是室内质控，要想获得良好地真实地结果，把好操作关，才能保证免疫组化真正起到提示、验证病理结果及指导临床治疗的作用，而室间质控终究不是各实验室自身能解决的问题，作为我们基层工作人员翘首以待，唯室内质控可解燃眉之急，而免疫组化室内质控尚在初级阶段，本科自开展室内质控以来，略有体会。现将对室间质控的期盼与本科室内质控开展的体会讨论一下，望各位同道批评指正。
尽管免疫组化在我国开展已有近20年的历史，但是各级医院设备相差悬殊，技术力量水平不一，且普及到中、下层医院还是近几年的事，所用试剂尽是国外产品，只有一粗略说明书，哪怕倒背如流，在实际工作中仍会遇到一些一时难以解决的问题:结果可信度;抗体效价;结果判定标准;防脱片剂的应用;反应时间与温度的关系;实验室温度冬夏温差太大;阴阳对照;PBS缓冲液冲洗度与量;抗原修复等。介于以上问题，我们急于期盼中心实验室早日开展室间质控与调查，及室内质控的指导工作，现将对中心实验室的室间质控的期盼与我科近几年室内质控开展体会讨论如下:
1 对室间质控及室间调查的期盼
1.1 中心实验室应指出各试剂间的差异及优缺点，建议统一使用的试剂品牌，减少试剂误差。
1.2 严格规定操作规程，从取材、固定到操作等，甚至阳性判断标准。
1.3 建立统一的抗体效价测定方法，并提供给各基层实验室，以便在效期内定期检测。
1.4 每年给基层实验室定期发放同一份未知阳性标本，统计各实验室误差。
1.5 作好各实验室技术指导，基层医院有联网、有问题可随时解决。
1.6 定期召开质控会议，提供资料，褒优批劣，促进免疫组化的室间质控。
2 本科免疫组化室内质控体会
2.1 严格操作规程，制定从取材、固定、脱水等到结果判断标准。
2.2 比较厂家试剂，一旦确定不轻易更换，尽量用中心实验室推荐试剂。
2.3 自制室内质控片、蜡块，用于监控效期内抗体效价，及日常操作中的质控。
2.4 关于防脱片问题 （1）由于基层标本量少，不形成批量，防脱片剂每次配制太多，造成大量浪费，实践证明不需每次现配。少量配，（以APES防脱片剂为例）每用前现涂:吸0.1ml，加丙酮至5ml，4℃冰箱可放置1月，有明显变黄，沉淀方可弃去。（2）玻片提前清洗干净，用1%盐酸酒精浸泡后，再用弱碱性洗涤剂清洗，以除去玻片表面的脂质及盐类，用清水洗净，最后用酒精浸泡擦干备用。（3）如稀释防脱片剂量太少不能浸泡，可先用酒精灯将玻片预热至60℃左右，用手背试微烫，然后用微量吸管吸取约40～50μl的1:50稀释的APES防脱片剂，均匀涂于玻片，干燥后，即可捞片。每次现涂（可免去用丙酮或蒸馏水冲刷的一步）。（4）烤片时间:如第2天工作免疫组化可60℃烘烤过夜，当日操作可80℃烘烤25min。（5）捞片必须一次成功 ［1］ ，防止气泡形成而脱片，也防止玻片上的APES防脱片剂溶解在水中而脱片。（6）切片尽量薄，以3μm厚为佳，实践证明厚片较薄片易脱落。（7）溃疡坏死组织易脱片。（8）冲洗过猛易脱片。（9）整批脱片为防脱片剂处理不当;单张脱落为捞片不当或标本本身所致，如溃疡糜烂组织。（10）为防止个别脱片，每份标本多准备1～2张备用片，操作同步，至抗原修复后，易脱片步骤基本过去，方可将备用片弃掉，但会造成修复前3%H 2 O 2 用量大，与一抗、二抗不同步用完，根据本科经验，可用临床使用的3%H 2
O 2 代替，效果一样。（11）二步法试剂可节省步骤 ［2］ ，减少洗涤、加液次数，从而减轻脱片。（12）APES防脱片剂易燃、易挥发、易与玻璃制品结合，应存放密闭的塑料瓶中。本室买成品APES防脱片剂由于原包装封闭不严，1个月后就挥发0.5ml左右，大量结晶在封口处形成，原液有结晶下沉，后转放玻璃磨塞瓶中，又解不开瓶塞，粘在一起，只好用玻璃刀切去一截才倒入密闭塑料瓶中。（13）为防止脱片，如头一天切片，可烤完片后第二天脱蜡至水后再进行免疫组化操作。如头一天脱蜡至水，用PBS缓冲液浸泡一夜可加剧脱片。
2.5 组织块大小与试剂显色的关系 应在显微镜下选择有意义的组织块，如组织块太大，可在脱蜡至水后用锋利的刀片将组织块切至所需大小，一般以0.6～0.8cm 2 为佳。因所有试剂都带滴嘴，一滴约50μl，标本太大、抗体量太少，可显色不足，必须多加试剂才能纠正，由于试剂太贵，加半滴要滴口与标本接触，又易将片中液体带入试剂，造成试剂污染与稀释，从而降低抗体效价。
2.6 对于反映温度与时间问题 凡是要求在37℃反应或4℃过夜的试剂，工作中可遇到加一抗、二抗时间安排不合理，从而延长工作时间。如11点加一抗，下午2点上班就超过一抗1～2h规定时间，反应时间过长可造成假阳性，所以工作人员经常不能按时上下班。本科经验，根据下列温度与时间关系图，将温箱按中午休息时间调到图中夹角所示温度或最长不超过表中所示温度，即可上班后加二抗，如上午11点加一抗。将温度调至34℃，即可在下午2:20以前加二抗，工作人员可自行安排时间。但应注意表中的时间为一分率:0.5h为30min;0.75h为45min，依次类推。横轴为时间，纵轴为温度。方便实用，经对照结果差异无显著性（见图1）。
注意:显色时间过长阳性强，显色时间太短阳性程度弱。不得超过表中所示时间，应控制在图中的两条斜线的夹角区内。
图1 一抗反应温度与时间对照表
2.7 DAB显色时间 DAB显色时间长短不一可造成阳性程度不一（尤其对弱阳性标本）。规范显色时间至关重要，说明书中3～10min界限太大。标本量多时可分批操作，尽量缩短时间差。
2.8 对于要求室温反映的试剂 标准实验室温度是18～22℃，实际工作中却不然，条件差的实验室冬天可低于12℃，夏天可高于37℃，冬夏温差可达45℃。一切酶促反应温度最关键，反应程度也冬夏有别，也是造成结果不稳定的具体原因。此种试剂可把温箱调至室温范围反应，以达结果质量恒定。
2.9 本科试剂质控 由于某些基层实验室标本量太少，而试剂包装量大些，造成效期内抗体滴度下降，由于抗体效价与储放时间成反比关系，且为一渐进过程，掌握抗体效价，是试剂质控的重要环节。我科是选用阳性强度不同的标本，在新购试剂时，于效期内，对试剂进行定期测定，观察其稳定性，降一个（+）即不再使用。
2.10 密切观察冰箱温度 上下格、内外位置的温度，尽量放4℃位置，且不可反复冻融。
2.11 为避免操作中的系统误差、偶然误差可自制室内质控物，以弱阳性和阳性两种为佳 随每批标本作室内质控。（因每批试剂只带1～2张阳性对照可对室内质控物进行监控）自制室内质控物方法是:将定好阳性程度的标本多做蜡块，每次切十张，烤干备用，每次取两张随常规操作，观察其稳定程度。室内质控物如弱阳性变（-）或增至一个（+）以上，而阳性质控物由（+++）降至（++）或增至（++++），差出一个（+），即为失控，要立刻寻找原因，并记录在质控图上，分别将弱阳性（±）和阳性（+++）两种质控物每次所测结果在质控图上绘出曲线，进行统计，即可看出系统误差或偶然误差。
2.12 PBS缓冲液冲洗的量、酸碱度、冲力均为显色影响因素 （1）配好的PBS缓冲液应用0.1M盐酸或氢氧化钠调至所需酸碱度。（2）用量以每块标本每次冲洗0.5ml为宜。（3）冲力以水柱断续为佳，冲力过大阳性偏低并易脱片，冲力偏小背景显色。冲力集中时易周边背景显色。如标本太大应移动冲洗，不要只冲一个点。但注意不要集中力量冲 洗标本边缘及溃疡糜烂面，防止脱片。
2.13 滴加试剂前应尽量将PBS缓冲液沿组织块周围用滤纸吸净，防止试剂稀释显色不佳。
2.14 着色定位 染色成功的组织背景清晰，定位明显，核、浆、膜着色与临床病理相符或基本相符，如失控需寻找原因。除操作原因外，是否有非特异性多克隆抗体存在，并注意标本前期处理的操作方法是否恰当。再者室内质控片是否清晰，如清晰，即为个体差异，或偶然误差。
2.15 复染 大多数实验室用苏木素复染，少数不复染观察。但由于染苏木素核为蓝紫色，尽管染色时间比常规缩短很多，一定程度上仍可与DAB显色顺色，而不复染又影响观察病理组织结构。本室以甲基绿为复染剂，核绿色与黑褐色有明显反差，又能观察组织结构。
2.16 抗原修复 （以微波修复为例）经多次测量温度，观察高、中、低火与时间的关系。本科以中火4min，观察加液后，停置5min，开低火5min，温度可保持92℃～95℃，后放置10～20min。
2.17 抗原暴露用酶消化液 一次不要配太多，标本少，可用滴加法，剩下4℃保存可用1周。
2.18 切片应以3μm为宜，因界限3～5μm，5μm厚接近3μm的1倍，细胞层次多，阳性强度错觉性地增强。
2.19 良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，在浸蜡温度固定的条件下，随大批量标本固定、脱水，往往固定脱水不好，应专用中性甲醛固定及酒精中脱水，以保证质控效果。
2.20 特异性背景着色 （1）染色过程中避免干燥和冲洗不彻底。（2）血清蛋白密封不充分。（3）内源性过氧化物酶未完全阻断（含血标本尤甚）。（4）内源性生物素未阻断（肝、肾、胰腺，含中性粒细胞组织）。（5）未及时固定或固定不佳标本。（6）防脱片剂太厚。（7）缓冲液酸碱度未调。2.21 结果判断标准 各厂家试剂敏感度及特异性均不一致，在厂家试剂确定后，我科判断标准根据核、浆、膜定位的数量及显色强度，将结果分为（-）～（++++）六级:（1）间质清晰，无背景着色，无肿瘤细胞着色为（-）。（2）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色达1%～5%为（±）。（3）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色及阳性强度达5%～25%为（+）。（4）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色及阳性强度达25%～50%为（++）。（5）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色及阳性强度达50%～75%为（+++）。（6）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色及阳性强度达75%以上为（++++）。
综上所述，免疫组化操作较简单，影响因素却较多，工作人员必须以高度责任心、娴熟的技术操作、严格的操作规程、完善的室内质控制度、紧密结合病理组织学，并有中心实验室的室间质控及室间调查监控，才能取得满意结果，为病理、临床提供可信的信息。
（收稿日期:2004-06-10） （编辑江 风）
作者单位:265701山东省龙口市人民医院病理科