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【摘要】 目的 探讨塞来昔布对大肠癌细胞侵袭能力和转移能力的影响，以及对肿瘤血管生成的影响。方法 用Matrigel体外侵袭实验检测塞来昔布对LoVo细胞体外侵袭能力的影响;建立Lovo细胞裸鼠肝转移模型，检测塞来昔布对LoVo细胞肝转移能力的影响;用CD34免疫组化染色方法检测肝转移瘤的微血管密度（MVD），了解塞来昔布对肿瘤血管生成的影响。结果 塞来昔布能显著降低LoVo细胞的体外侵袭能力。塞来昔布能显著减少裸鼠LoVo细胞肝转移模型的肝转移数量，对照组98.83±10.42，用药组63.4±5.59（P<0.01）。用药组的微血管密度均明显低于对照组（P<0.01）。结论 塞来昔布能明显降低LoVo细胞的体外侵袭能力和在裸鼠体内的肝转移能力，并能抑制转移瘤的血管生成。
关键词 塞来昔布 大肠癌 侵袭 转移 血管生成
The influences of celecoxib on the invasive and metastatic abilities of colorectal cancer cells
Zhao Leiguang，Wan Yuanlian，Zhu Jing.
Department of General Surgery，the First Hospital of Beijing University，Beijing100034.
【Abstract】 Objective To study the influences of celecoxib on the invasive and metastatic abilities of colorecˉtal cancer cells，and the influence on tumor angiogenesis.Methods Matrigel invasion assay was used to observe in vitro the influence of celecoxib on the invasive ability of LoVo cells.The liver metastasis model was established in nude mice to illustrate in vivo the effect of celecoxib on the metastatic ability of LoVo cells.Microvessel density of the metastatic nodules was analyzed by immunohistochemistry in CD34-stained tumor sections to observe the influence of celecoxib on tumor angiogenesis.Results In vitro invasive ability of LoVo cells was significantly inhibited by treating with celecoxib.Nude mice of treated group developed fewer liver metastatic nodules than those of control group，63.4±5.59vs98.83±10.42（P<0.01）.MVD of treated group was significantly lower than that of control group（P<0.01）.Conclusion Celecoxib can effectively inhibit invasion in vitro and liver metastasis in nude mice of LoVo cells.Celecoxib treatment effectively inhibit cancer angiogenesis in metastatic nodules.Key words celecoxib colorectal cancer invasion metastasis angiogenesis
大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，目前，虽然采取了手术及放、化疗等综合治疗手段，对于此类肿瘤的治疗取得了一定的进步，但对肿瘤的转移和复发，仍然缺乏有效的预防和治疗手段，因而转移和复发始终是此类肿瘤治疗的难点所在和影响患者长期生存的重要因素。
近来研究发现环氧合酶同工酶（Cyclooxygenase-2，COX-2）与肿瘤发生、发展、转移有着密切的关系，从而，其抑制剂非甾体抗炎药（nonsteoidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs），在肿瘤防治中的作用日益受到关注。本实验采用新一代选择性COX-2抑制剂塞来昔布（celecoxib），研究其对大肠癌细胞系LoVo细胞的侵袭和转移能力的影响以及对转移瘤血管生成的影响。从而探讨其用于预防大肠癌转移的可能性。
1 材料
1.1 细胞 NIH/3T3细胞以及人大肠癌细胞系LoVo均源自ATCC，由我院大肠癌实验室冻存。
1.2 主要试剂与耗材 塞来昔布纯品购自安徽合肥森瑞股份有限公司，D-MEM培养基、胰蛋白酶为Gibco公司产品，胎牛血清产自天津生物制品厂，大鼠抗小鼠CD34单克 隆抗体购自BD公司，生物素标记的兔抗大鼠IgG抗体、链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自中山公司，Matrigel TM Matrix购自BD公司，8.0μm聚碳酯膜Transwell为Corning Costar公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
1.3 动物 8周大的BALB/cAnN-nu/nu雄性裸鼠购自中国医学科学院动物中心，委托北京大学实验动物中心饲养。1.4 仪器 德国产Heraeus二氧化碳孵育箱，日本产Olymˉpus IX70倒置相差显微镜、Olympus CK2倒置显微镜，北京半导体设备一厂产月坛牌洁净工作台。
2 方法
2.1Matrigel侵袭实验取传代第2天长势良好的NIH/3T3细胞制备趋化因子，按说明书将Matrigel铺于Transwell板上。取对数生长期的LoVo细胞分为3瓶，培养贴壁后加药，分为对照组，塞来昔布5μmol/L和10μmol/L组（均含5‰DMSO），继续培养48h，用PBS漂洗3次，用无血清D-MEM制备单细胞悬液，5×10 5 细胞/ml，台蓝兰拒染试验细胞活力大于95%，Transwell培养板上室加入100μl细胞悬液（5×10 4 细胞）并加入无血清D-MEM200μl，Transwell培养板下室加入500μl趋化因子，37℃，5%CO 2 培养24h。擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞，取出上室，用冰甲醇固定30min苏木素染色1min梯度酒精脱水，二甲苯透明。将聚碳酯膜取下，置载玻片上中性树脂封片。在高倍镜下（400×）随机取6个视野计数，取平均数。重复实验2次。
2.2 塞来昔布对裸鼠肝转移模型中LoVo细胞肝转移能力的影响
2.2.1 裸鼠LoVo细胞肝转移模型的建立 裸鼠腹腔内注射3%水合氯醛麻醉（按0.01ml/g计算），以75%酒精消毒，于左肋缘下0.5cm处切口暴露脾脏。以TB针将0.2ml（2×10 6 ）LoVo细胞悬液注入脾实质。拔出针头，注射点用75%酒精棉球压迫止血并杀死外渗的瘤细胞。还纳脾脏，细丝线分两层缝合切口。
2.2.2 给药 将12只裸鼠随机分成两组，每组6只，自接种肿瘤次日起给药，实验组喂含1250ppm塞来昔布的饲料，对照组喂普通饲料。
2.2.3 结果判定 用药35天时，引颈法处死所有裸鼠。解剖出肝脏，称重，计数肝脏表面肉眼可见的转移灶。
2.3 免疫组化法检测塞来昔布对转移瘤微血管密度（MVD）的影响
2.3.1 免疫组化染色（SP法） 裸鼠肝脏经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，每个标本于大的转移灶处切片3张。石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，灭活过氧化氢酶，修复抗原，加一抗工作液（以1:50稀释），4℃过夜，PBS2min×3，滴加二抗（1:200稀释），室温孵育30min，PBS2min×3，滴加三抗工作液，室温孵育30min，PBS洗片2min×3，DAB染色，苏木素复染，脱水、透明，封片。
2.3.2 MVD的测量 先是在低倍镜下寻找“热点”（hotspot，即新生血管最密集区），然后，以高倍视野为标准计数染成棕色的血管数目。
2.4 统计学方法 使用SPSS10.0软件进行统计学处理。所有数据均用均数±标准差表示，两组间差异的比较使用两独立样本均数t检验，多组间比较采用方差分析，α=0.05。
3 结果
3.1 塞来昔布对LoVo细胞体外侵袭能力的影响 Matrigel体外侵袭实验显示，塞来昔布能降低LoVo细胞体外侵袭能力。如图1、图2所示，各用药组LoVo细胞穿越Matrigel迁移至Transwell板聚碳酯膜下表面的细胞数量均少于对照组，且高浓度组少于低浓度组。组间比较差异具有显著性。图1 塞来昔布对LoVo细胞体外侵袭能力的影响（P<0.01） 图3 塞来昔布对裸鼠肝转移瘤数目的影响（P<0.01）图4 塞来昔布对裸鼠肝脏重量的影响（P<0.01）
3.2 塞来昔布对LoVo细胞肝转移能力的影响 术后第3天用药组1只裸鼠死亡。处死时用药组的一般状况好于对照组。用药组转移灶数量和平均肝重明显低于对照组，对肝转移的抑制率为35.8%。组间比较差异具有显著性。（见图3、4、5）。
3.3 塞来昔布对转移瘤MVD的影响 如图6、图7所示，治疗组微血管密度（每个高倍视野下CD34阳性的微血管数）均明显低于对照组，差异具有统计学意义。图6 塞来昔布对转移瘤MVD的影响（P<0.01）
4 讨论
越来越多的证据表明，环氧合酶同工酶（COX-2）的过表达与大肠癌、胃癌、肝癌、乳癌肺癌等多种肿瘤密切相关，且COX-2高表达者具有更强的侵袭性和转移倾向，预后不良。Tomozawa等 ［1］ 研究发现结肠癌的血行转移、淋巴转移及肿瘤复发与COX-2高表达有关，Murata ［2］ 发现胃癌COX-2表达水平与胃壁淋巴管浸润及淋巴结转移正相关。COX-2的高表达的结直肠癌更容易复发和发生肝转移 ［3］这些都表明COX-2有可能在促进肿瘤侵袭转移的过程中发挥重要作用。实验证明经阿司匹林或选择性COX-2抑制剂NS-398处理后肝癌细胞侵袭能力下降 ［4］ ，塞来昔布能明显减少异位接种Lewis肺癌C57小鼠的肺转移数目 ［5］，选择性COX-2抑制剂罗非昔布抑制荷人结肠癌裸鼠的肺转移 ［6］ ，提示非甾体抗炎药有望成为预防肿瘤转移的新手段。非甾体类抗炎药抑制肿瘤侵袭转移能力的机制尚不完全清楚。研究表明，COX-2高表达可上调唾液酸化的Lewis抗原 ［7］ ，肿瘤细胞的粘附能力和转移能力也随之增强。COX-2抑制剂塞来昔布能够抑制这种粘附分子的表达及肿瘤细胞的粘附能力。上皮型钙粘素（E-cadherin）是一种细胞间联系蛋白，其表达下调可导致细胞恶性表性增强，具有更强的侵袭能力。文献报道COX-2抑制上皮型钙粘素的表达，非甾体类抗炎药可能通过抑制COX-2上调上皮型钙粘素 ［8］ 。基质金属蛋白酶（MMP）是降解细胞外基质的酶，是肿瘤细胞转移浸润的重要机制。非甾体类抗炎药可抑制MMP-2的合成 ［9］，这可能是其抑制肿瘤转移的一个原因。
另外，血管生成与肿瘤的侵袭转移过程密切相关。已有报道非甾体类抗炎药可抑制血管生成。研究表明，肿瘤新生血管的内皮细胞往往有较强的COX-2表达 ［10，11］ 。COX-2可以刺激促血管生成因子如VEGF等的表达，从而导致肿瘤新生血管生成 ［12］ ，非甾体类抗炎药可能通过抑制促血管生成的因子表达来发挥抗血管作用。目前多数研究表明，非甾体类抗炎药的抗肿瘤作用主要与抑制COX-2有关，因此人体耐受性较好的新一代非甾体类抗炎药选择性COX-2抑制剂日益受到人们的关注。我们的研究表明，选择性COX-2抑制剂塞来昔布能够抑制大肠癌细胞系LoVo的体外侵袭能力以及在裸鼠体内的肝转移能力，并能抑制转移瘤的血管生成。我们用于治疗组裸鼠饲料中塞来昔布浓度为1250ppm，每只裸鼠平均每天进食约4g，每天摄药量约200mg/kg，小鼠代谢旺盛，为达到相当血药浓度每公斤体重需用药剂量为人类的10～20倍。塞来昔布用于抗炎镇痛推荐剂量为200～400mg， 每天2次。以此推断，在目前临床常用剂量范围之内，即有可能在人体内产生抗转移活性，因而有望成为临床上用于预防大肠癌转移的有效药物。 （本文图2，5，7见附页2）
参考文献
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作者单位:100034北京大学第一医院普通外科
（收稿日期:2004-06-04）
（编辑江 风）