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【摘要】 目的 建立板蓝根药材的评价方法。方法 采用TLC法进行有机酸薄层色谱鉴别，采用HPLC法进行腺苷类成分的含量测定。结果 两种方法均操作简单，重复性好，准确可靠。结论 可利用此方法控制板蓝根药材的质量。
Ma Lin，Zeng Lingjie，Liang Huiyu
China Medicine Factory，Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Co.，Guangdong510515.
【Abstract】 Objective To establish a method to evaluate Isatis indigotica Fort.Methods TLC were chosen to identify organic acids.The con ent of adenosine was determined by HPLC.Results This two chromatogram method are easy to be operated and had goog repeatability.Conclusion This standard can be used to control the quality of Isatis indigotica Fort.
Key words isatis indigotica fort organic acids adenosine
板蓝根为十字花科植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，始载于《神农本草经》。有清热解毒、凉血利咽之功效，在我国广为栽培。近年来研究表明板蓝根具有较强的抗菌、抗病毒和抗内毒素的作用 ［1］ 。板蓝根中的有机酸具有很强的抗内毒素作用 ［2～4］ 为板蓝根清热作用的主要成分，有学者认为板蓝根中的核苷、碱基及吲哚类化合物为抗病毒的活性成分，但2000版《中国药典》一部标准项下均无这些成分的鉴别或含量测定项，只有荧光和氨基酸的定性鉴别项，专属性不够强，难于控制板蓝根药材的质量。为此拟在2005版药典板蓝根的质量标准提出修订，我们受委托承担了该品种的2005版药典的质量标准修订及起草工作，删除了原标准中的荧光和氨基酸鉴别项，增加了以对照药材为对照的有机酸鉴别项和腺苷的含量测定项，有效地控制和评价了板蓝根药材质量。
1 仪器、试剂和药品
层析缸（22×12cm），铺布器，薄层加热器，Agilent1100系列高效液相色谱仪，Agilent自动进样器，Agilent DAD检测器;薄层层析硅胶（青岛海洋化工有限公司），羧甲基纤维素钠（上海化学试剂厂），乙腈（色谱醇，美国Tedia公司），水为乐百氏纯净水，其余试剂均为分析纯;板蓝根对照药材，对照品腺苷批号（0797-9803供含量测定用），由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2.1 板蓝根中有机酸的鉴别
2.1.1 层析条件 展开系统:氯仿-丙酮-甲酸（5∶4∶1）;点样量:5μl;显色剂:0.5%溴甲酚绿乙醇溶液，喷雾后置于薄层加热器上加热至斑点清晰（约30min，在蓝色的背景上显黄色斑点）。层析图谱见图1。
2.1.2 对照药材溶液和供试液的制备 取对照药材粉末或药材粉末10g置于100ml锥形瓶中，加入25ml乙酸乙酯，用1MHCl调节pH至2～3，用超声提取15min，过滤，滤液浓缩至干，用1ml甲醇溶解。
图1 板蓝根药材中的有机酸成分的TLC图谱（略）
2.1.3 图谱中的样品（产地）顺序 从左至右依次为:1.东北，2.山东，3.河北，4.对照药材，5.安徽（阜阳），6.安徽（邓庙），7.安徽（临泉）。
2.2 板蓝根中腺苷的HPLC含量测定
2.2.1 色谱条件 ODS C18色谱柱（10μm，250×4.6mm）;流动相:乙腈一水（6:94）;流速:1.0ml/min;检测波长:260nm;进样量:10。
2.2.2 对照品液的制备 精密称取腺苷10mg，置50ml量瓶中，加甲醇稀释于刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度（40mg/ml）。
2.2.3 供试品溶液的测备 取本品粉末1.0g，精密待定，精密加水入20ml，称量，超声提取，30min，称重，以水补足损失的重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.4 线性范围的考察 精密量取腺苷对照品液（0.2003mg/ml）分别进样2.5、5、、10、15、20、25μL，按上述色谱条件测定其峰面积。以腺苷进样量为横坐标，、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=1235.4X+94.386，r=0.998。结果表明腺苷在0.5008～5.0080Hg时与峰面积值呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验 取腺苷对照品溶液10μL，重复进样6次，测定腺苷峰面积值，结果其RSD=0.86%。
2.2.6 稳定性试验 取供试品溶液分别于0、2、4、6、8h进样10HL，没得样品中腺苷的含量的峰面积值的RSD=0.83%，结果表明供试品液在6h内稳定。
2.2.7 重现性试验 取同一样品6份，按上述方法制备供试品溶液，测定其中腺苷峰面种，其RSD=1.91%（n=6）。
2.2.8 回收率试验 取已测定腺苷含量为0.1469mg/g的样品0.5g精密待定，精密加入腺苷对照品0.0734g;按上述制备供试品溶液的制备方法操作，结果平均回收率为97.3%，RSD=3.8%。
2.2.9 样品含量的测定 取6批样品按照制备拟定方法制备样品溶液。腺苷含量测定方法测定样品中的腺苷的含量，结果见表1，色谱图见图2。
表1 板蓝根药材中腺苷的测定结果 （略）
图2 腺苷对照品（A）和板蓝根（B）的HPLC图（略）
3 讨论
3.1 有机酸为板蓝根清除热源（内毒素）的主要成分，为板 蓝根清热解毒的活性成分之一，但长期以来没有建立其质量分析方法的标准，本文在这方面进行了探讨，并进行了质量评价标准。在有机酸薄层色谱方法的探索中，对提取溶剂和提取方法进行了对比分析，如用甲醇、乙酸乙醋、氯仿、丙酮作为提取溶某进行考察;同时对超声提取，加热回流及加入1MHCl的量进行考察，制备各种供试品溶液，经过筛选，得到的本实验方法为最佳前处理方法。
3.2 TLC层析比较了多种不同中性、酸性、碱性、展开系统，最后确定以氯仿:丙酮:甲酸系统，以（5:4:1）为最佳比例。
3.3 许多学者认为板蓝根抗病毒活性与其中的核苷类或吲哚类化合物密切相关，我们通过抗病毒实验筛选得到了其中抗病毒活性较强的部位，该部位中含有腺苷，腺苷的含量与该部位的抗病毒活性有一定的相关性，故我们以腺苷作为指标成分，建立了板蓝根中的腺苷成分的含量测定方法。
3.4 腺苷测定方法的研究中，比较了不同系统和比例的流动相，如:甲醇-水，甲醇-水-磷酸，醋酸钠缓冲溶液（pH5.8）—甲醇，醋酸钠缓冲溶液（pH5.8）-乙腈，通过比较确定以水-乙腈（6:94）分离效果较好。
3.5 本文条件下进行有机酸TLC层析和腺苷的HPLC定量分析表明，不同产地药材有机酸图谱对比清晰，腺苷含量也有较大差距，能够明显鉴别出板蓝根药材的优劣，为建立一种更准确地评价板蓝根药材的标准提供了参考。
参考文献
1 国家中医药管理局.中华本草（上册），上海:上海科学技术出版社，1996，701-704.
2 Wu Xiaoyun，Liu Yunnan，Sheng Wangyun，et at.Constituents of Isatis indigaotica.Planta Medical，1997，63（1）:53-57.
3 李彬，陈万生，杨根金，等.四倍体板蓝根中的有机酸类成分.第二军医大学学报，2000，21（3）:68.
4 张汉明，张戈，乔传卓.板蓝根和大青叶不同部位的靛蓝.靛玉红含量测定及其部分成分的抗内毒素作用比较（摘要）.药学实践杂志，2000，18（5）:347.
（收稿日期:2004-05-27）
作者单位:510515广东省广州白云山制药股份有限公司中药厂
（编辑罗 彬）