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【摘要】 目的 通过X线、免疫组化及BMP原位杂交的方法探讨Ⅰ期植骨对兔感染性骨缺损的治疗效果。方法 健康家兔50只，体重2.0～2.5kg，雌雄不限，制成骨缺损型骨外露，取感染骨缺损为实验类型，分为6组。结果 （1）感染创面植骨后经过炎症反应、软骨内骨化逐渐转变成骨组织;（2）通过X线和BMP的原位杂交可以观察到兔桡骨感染性骨缺损的Ⅰ期植骨可达到临床愈合。结论 通过对兔桡骨感染性骨缺损的Ⅰ期植骨的成功治疗，为感染性骨缺损和骨髓炎的Ⅰ期植骨治疗提供可靠的理论依据。
关键词 感染性骨缺损 原位杂交 Ⅰ期植骨
To investigateⅠstage implanting bone to an experimental study of
rabbit infectious bone defect
Li Chengfu，Yang Yubao，Li Lin，et al.
Department of Orthopedics，Affiliated Hospital of Medical Collage，Yanbian University，Yanji133000.
【Abstract】 Objective To investigate the therapeutic effect of I implanting bone on rabbits infectious by the way of X-ray，histological and situ hybridization.Methods 50adult healthy rabbits，either sex.weighting from2.0to2.5kg.were made the bone defect model exposed to air，the infectious rabbits were used as experimental model.they were divided into6groups randomly.Results （1）After implanted bone spongy，the infectious wound went through inˉflammation reaction，os
sification and then turned into bone tissue.（2）X-ray and situ hybridization of BMP-2;I imˉplanting bone to osteomyelitis bone defect of rabbit can get to clinical therapy.Conclusion I implanting bone has good effect on rabbit infectious bone defect.It provide some reliable theory to clinical therapy for infectious and osˉteomyelitis bone defect.
Key words infectious bone defect situ hybridization I stage implanting bone
随着社会的快速发展，交通工具日益增多，交通事故越来越多，致使许多开放性骨缺损的感染患者大量增多。传统的治疗方法是先进行彻底清创和抗炎治疗，待伤口闭合半年后再进行Ⅱ期植骨修复骨缺损或带血管骨及皮瓣移植来治疗，此种方法经历时间较长，且对带血管骨移植技术要求较高，并且有较高失败率，这样既增加了病人痛苦，也增加了患者的经济和精神负担。为此我们对兔桡骨制成感染性骨缺损模型进行实验研究，以期望为临床Ⅰ期植骨治疗感染性骨缺损提供必要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型及标本的制备 健康家兔50只，体重2.0～2.5kg，雌雄不限，选择左侧桡骨为实验组，用手外科骨钳在有菌条件下制成2cm的骨外露性骨缺损并切除部分皮肤充分暴露断端，雌雄分开，分院饲养。一周后选30只伤口有感染并有脓性分泌物的家兔分成6组，取脓性分泌物做细菌培养和药敏试验，伤口用生理盐水、双氧水和碘伏充分消毒，并用手外科小刮匙对骨断端及肉芽组织进行刮除。根据细菌培养和药敏试验结果，选用敏感药物和家兔异体髂骨骨松质充分混合后置于骨缺损处，以后用敏感抗生素于耳缘静脉注射5天，给于消炎。分别于植骨后1、2、4、6、8周摄X线片，并处死动物取材。用Buoin液进行固定24h，15%EDTA于4℃环境下脱钙（pH7.0～7.2），每周更换一次，待用大头针可刺入骨皮质后，终止脱钙，用自来水冲洗标本过夜，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片后进行HE染色和原位杂交，光镜下观察。
1.2 主要试剂及器械 X线摄片机（FG-400西南医用设备厂产品）;BMP-2原位杂交试剂盒（武汉博士德公司产品）;DAB显色系统（北京中山技术有限公司产品）;DFPC水（北京华美技术有限公司产品）;Buoin液（饱和苦味酸75ml，福尔马林25ml，冰醋酸5ml）。
1.3 方法 （1）在1、2、4、6、8周处死动物前对兔子前肢骨折缺损摄X线片。（2）HE染色切片厚度为4μm，脱脂至水，进行苏木素染色，脱水，封蜡。（3）原位杂交研究 探针的标记及原位杂交的反应程序，按地高辛试剂盒说明书进行，探针序列为:（1）5′-CCGTC TTCTA GCGTT GCTGC TTCCC GAGGT-3′;（2）5′-TTTCC ATCAC CGAAT TAATA TTTAT GAAAT-3′;（3）5′-TCAAG CCAAA ACAGC GGAAA CGCCC-3′，切片经脱蜡至水后，用3%的过氧化氢封闭内源酶，胃蛋白酶消化暴露mRNA核酸片段，4%多聚甲醛固定10min，用DEPC双蒸水洗涤处理后，加预杂交液4h（40℃），杂交15h（40℃），依次经2XSSC、0.5XSSC、0.2XSSC溶液充分洗涤，加地高辛抗体（37℃）1h，最后用地高辛检测试剂盒检测或DAB显色系统显色。增强剂处理，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
2 结果
2.1 HE染色 一周时骨折端有大量炎性细胞浸润，骨折缺损处可见少量肌纤维进入缺损区。2～4周时有大量成纤维细胞及血管的增生，有软骨细胞生成，并开始软骨内化骨。6周时间充质细胞向软骨内细胞转化过程及软骨内细胞增殖分化的过程趋于停顿，并有较多的骨小梁形成。8周时有正常的骨痂形成，无软骨细胞出现。
2.2 X线摄片观察 1周无明显变化，2周有明显骨痂形成。4周骨痂明显增多。6周骨缺损处模糊。8周骨缺损有大量骨痂形成，缺损消失。
2.3 原位杂交方法 术后1周，BMP-2染色呈棕黄色，这与移植后一周时移植骨区内有许多间充质细胞生成有关;2周时BMP表达呈棕黄色，这是由于软骨细胞的生成和部分间充质细胞有关;4周时BMP染色呈棕黑色，于4周时有大量软骨细胞生成和大量纤维组织增生有关;6周呈淡棕色;8周几乎呈阴性;6～8周时骨的改进修复过程几乎停止，内部间充质细胞和软骨细胞减少，大量纤维组织已经钙化。
3 讨论
创伤、恶性肿瘤、感染均可造成节段性骨缺损，对于开放性的感染性骨缺损的治疗，传统的治疗方法是进行病灶清除并辅以全身的抗生素治疗，待炎症消失肉芽覆盖创面后在骨缺损处行Ⅱ期植骨 ［1］ 。许多学者对此进行了大量实验研究，如1878年Macewen ［2］ 为1例3岁顽固性骨髓炎患儿切除肱骨干，植入取自6个人的异体骨获得成功。近1个多世纪来，对骨缺损的探讨较多，有自体骨、同种异体骨和人工骨移植。但对感染性骨缺损移植的报道较少，如袁志 ［3］ 曾用抗感染重组异体骨对兔胫骨骨髓炎做过治疗反应的实验研究，但这样治疗方法延长治疗时间，增加病人的痛苦及精神负担，为此袁志在重组合异体骨的基础上 ［1］ ，结合抗生素的缓释技术 ［4～6］ ，研究出具有有效成骨活性和强效抗感染异体骨治疗胫骨近端骨髓炎取得了重要进展。本实验从自然状态下造成兔桡骨感染性骨缺损，并非人为种植细菌做成感染模型。此模型比较接近现实的感染创面，取分泌物做细胞培养和药敏试验，确定细菌种类及敏感药物，取敏感药物与髂骨骨松质混合移植于骨缺损处对兔桡骨感 染性骨缺损进行治疗。实验结果证实HE染色发现一周时有大量炎性细胞浸润，并有少量纤维组织增生;2～4周时有大量纤维细胞及毛细血管增生并伴有软骨细胞形成;6～8周时软骨细胞转化过程几乎停止，骨小梁开始出现，有正常骨组织结构。X线显示1～2周有少量骨痂形成;4～8周时骨缺损处模糊，骨缺损消失，并能看出骨髓腔的形成。原位杂交显示1～2周时呈棕黄色;4周时呈棕黑色;6～8周呈淡黄色。
综上所述，本实验通过取敏感药物与髂骨骨松质混合移植于骨缺损处对兔桡骨感染性骨缺损进行Ⅰ期植骨的成功治疗，给临床治疗感染性骨缺损提供必要的理论依据。对感染性桡骨缺损的治疗的前提条件是必须对感染伤口进行细菌培养和药敏试验。根据试验结果选择敏感的抗生素，与髂骨骨松质进行混合移植，这样骨松质可作为一种载体对抗生素进行缓慢释放起到关键作用，并在术后联合应用抗生素进行消炎。通过实验可以看出Ⅰ期植骨对兔桡骨感染炎骨缺损的治疗，治愈率达到96%以上，是一种理想的治疗方法。但这仅从某一方面探讨治疗感染性骨缺损的治疗方法，在很多方面还有许多问题有待研究。希望有志之士在更多方面进一步深入探讨和研究。
参考文献
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作者单位:1 133000吉林延边大学医学院附属医院骨科
2 100700北京军区总医院骨科
（收稿日期:2004-08-12）
（编辑罗 彬）