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【摘要】 目的 研究并优化中国药典（2000版）天麻项下含量测定方法，为天麻及其含有天麻原生药粉制剂中天麻素含量测定提供更准确方法。 方法 用HPLC测定天麻中的天麻素含量，采用正交试验设计法考察天麻素的提取率。 结果 提取溶剂甲醇浓度变化影响因素最大。选择A2B2C3为最合适的提取条件，即40%甲醇为提取溶剂，加入30倍溶剂量，水浴加热60min，残渣用15ml溶剂超声洗涤3次，即得样品溶液，其线性范围、精密度、加样回收率结果均满足HPLC定量方法学要求。 结论 相同天麻样品，采用本方法测得的天麻素含量明显高于采用中国药典（2000版）方法测定的含量，其差别可达近20倍，本方法能更准确反映天麻中天麻素的含量。
关键词 天麻 天麻素 含量测定 HPLC 正交试验
Study on the determination of gastrodin content from
Gastrodia elate by HPLC in China pharmacopoeia（2000edition）
Ruan Jinghua，Liang Guangyi，Xu Bixue，et al.
The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences
【Abstract】 Objective To study and optimize the determination of gastrodin content in Gastrodia elata B1by HPLC in Chinese pharmacopoeia（2000edition），in order to find a better conditions to determine gastrodin content from G.elata Bl and the preparation contained the row material of G elata Bl.Methods Based on pretest the extraction rate was measured by orthogonal design.The gastrodin content was determined by HPLC.Results The factor of methanol concentration had significant influence on the determinating result of gastrodin content by HPLC.The best extraction condition was as:the sample was extracted by reflux in a water bath with40%methanol（the proportion of solid to liquid was1:30）for60min，and supersonic extracting15min again.Conclusion The extraction rate of gas-trodin by this extract process is obviously upper than that by the criterion method in Chinese pharmacopoeia（2000edi-tion），This method was preferable to evaluate the quality of G.elata Bl.
Key words gastrodia elata Bl gastrodin HPLC orthogonal design
天麻为兰科植物天麻（Gastrodia elata Bl）的干燥块茎，是一味著名的常用中药材，具有平肝息风止痉的功能 ［1］ 。天麻以天麻为原料制成的中成药较多，天麻的主要成分为天麻素，因此测定天麻中天麻素含量的报道也较多。测定天麻中天麻素含量的方法主要有反相高效液相色谱法（HPLC法） ［2～8］ 、双波长薄层色谱扫描法 ［9～11］ 、毛细管电泳法及紫外分光法 ［12］ 等，其中HPLC法应用最为广泛。中国药典（2000版）天麻含量测定项下规定采用HPLC法测定天麻中天麻素的含量，作为天麻质量控制的主要指标 ［1］ 。以上报道多为研究HPLC法方法学的考察及用HPLC法测定不同来源天麻中天麻素的含量，对从天麻药材中制备天麻待测溶液的提取工艺研究较少。为了考证天麻中天麻素含量测定方法的可靠性，为天麻中天麻素含量测定提供更准确可靠的方法，我们在中国药典（2000版）天麻含量测定方法的基础上，用单因素分析与正交试验设计法结合，考察了不同提取方法、提取溶剂甲醇的不同浓度对天麻素提取率的影响，结果表明提取溶剂甲醇浓度影响因素最大、选择水浴回流提取方法较好。
1 仪器与试药
美国惠普公司HP1100型高效液相色谱仪（包括四元泵，真空脱气机，自动进样器，柱温箱，DAD检测器）。HP1100/WIND-3D化学工作站。甲醇（色谱纯），磷酸二氢钾（分析纯），磷酸氢二钠（分析纯），二次蒸馏水;
天麻素对照品（中国药品生物制品检定所，批号:807-200104），天麻样品由贵州省植物园袁崇文教授鉴定。
色谱条件:色谱柱为Hypersil C18，5μm，ID，4.6×250mm（大连依利特科学仪器有限公司），预柱;流动相:甲醇-磷酸盐溶液（0.1mol/L磷酸二氢钾溶液和0.1mol/L磷酸氢二钠溶液等量混合）-水（2:2:96）为流动相;检测波长为270nm;流量:1.0ml/min;柱温:25℃。
2 试验结果
2.1 标准曲线的绘制 取天麻素对照品，加40%甲醇溶液配制成2mg/ml的对照品贮备液，精密吸取该贮备液，依次配制为0.05，0.10，0.40，0.70，1.0，1.2mg/ml的对照品溶液，分别吸取10μl，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，天麻素对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程:Y=1362.8X-4.0，r=0.9999。（图1）
2.2 精密度试验 精密吸取上述0.40mg/ml的对照品溶液10μl，连续进样5次，测定天麻素峰面积积分值，得平均积分值为769.12mAu·s，RSD为0.92%。（图2）
2.3 重现性试验 取试验方法制备的5份浓度相等的样品溶液各10μl进行测定，测定峰面积值，RSD为1.2%。
2.4 加样回收率试验 精密称定0.125mg天麻样品6份，每份分别精密加入天麻素对照品0.834mg，再按样品测定项下的方法处理样品，并进样测定，结果平均回收率为97.8%，RSD为3.9%。
图1 天麻素对照品色谱图 略
图2 天麻样品色谱图 略
3 试验讨论
3.1 单因素考察甲醇浓度的影响 试验结果表明，不同甲醇的浓度对天麻药材中天麻素提取效率有显著的影响。
3.2 提取方法的初步比较 考察了不同回流时间对提取效果的影响。通过初步试验，发现加热回流与静置-超声、超声-静置-超声及索氏提取法等方法天麻素提取效率相比，前者的效果较好。通过考察提取时间的影响，发现提取30min～120min测得的含量较高。因此拟将加热时间作为 设计正交试验的一个因素。
3.3 提取方法优化 根据天麻素的理化性质以及文献 ［6］ 与预试验结果，采用正交试验，以甲醇浓度、甲醇用量、回流时间、回流次数为因素，以L 9 （3 4 ）进行设计，其因素水平见表1，结果见表2。
3.4 试验结果 分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，计算即得。根据表3可知，影响天麻素测得含量因素主要为甲醇浓度，其次是回流时间。因此，各因素的较佳水平为A2B2C3D1。
3.5 样品的测定 取不同产地的天麻样品，精密称取经80℃干燥后的粉末0.25g，置100ml圆底烧瓶中，称定重量，精密加入40%甲醇75ml，称定重量，水浴回流60min，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，过滤，残渣用15ml溶剂超声洗涤3次。合并滤液，过微孔滤膜，进样分析。结果见表3。
表1 因素水平表略
表2 正交试验结果略
表3 样品测定结果 （略）
在初步试验时我们单因素考察甲醇浓度的影响，发现其对天麻素的提取效率有显著的影响。通过对不同产地的天麻的研究结果对比，发现该现象在天麻药材中普遍存在，初步认为中国药典（2000版）中采用甲醇为提取的方法不能将天麻中的天麻素提取完全，此外，文献报道采用HPLC法测定天麻中天麻素含量时，多采用甲醇为提取溶剂，测定出天麻素含量结果相对较低，影响了天麻素含量测定的准确性。我们认为采用40%甲醇为提取溶剂，能较完全地从天麻中提取出天麻素，有利于天麻素含量测定的准确性。
本试验考察了不同提取时间对提取效果的影响。通过初步试验，发现加热回流-超声与超声-静置-超声两方法天麻素提取效率相比，前者的效果较好。通过考察回流时间的影响，发现回流30～120min测得的含量较高。因此拟将静置时间作为设计正交试验的一个因素。并对优化结果进行了二次优化，所得结果证明正交试验设计较准确。
由于天麻质地较为坚硬，组成中多糖类成分较多，可能是甲醇不容易渗透到天麻粉末中，将天麻素较完全地提取出来的原因。
相同天麻样品，采用本方法测得的天麻素含量明显高于采用中国药典（2000版）方法测定的含量，其差别可达近20倍，本方法能更准确反映天麻中天麻素的含量，并提出了中国药典（2000版）测定天麻及其含有天麻原生药粉制剂中天麻素含量的方法有进一步改进的必要。
参考文献
1 中国药典（2000年版）一部，2000.
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12 沈卫平，顾雪中.天麻素紫外分光光度法定量探讨.时珍国医国药，1999，10（9）:666.
基金项目:科技部国家攻关计划资助项目（2001BA701A23-02） 贵州省科技厅资助项目（黔科农字〈2000〉1142号）
作者单位:1 550002贵州省中科院天然产物化学重点试验室
2 550004贵州贵阳贵州省宏宇药业有限公司
3 550002贵州贵阳贵州省植物园
（收稿日期:2004-07-09） （编辑一 凡）