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首页合作平台在线期刊中华实用医药杂志2004年第4卷第24期论著

蓝桉果实中三萜类成分体外抗肿瘤作用的研究

来源:中华实用医药杂志
摘要:【摘要】目的探讨蓝桉果实(FruitofEucalyptusglobulus)有效成分总三萜类化合物(eucalyptustriterperoidacid,ETA)(主要含熊果酸〈ursolicacid〉、白桦脂酸〈betulinicacid〉、白桦脂酮〈betulonicacid〉、2α,3β-二羟基熊果酸〈colosolicacid〉)的体外抗肿瘤作用。方法用MTT法检测ETA对16种肿......

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 【摘要】 目的  探讨蓝桉果实(Fruit of Eucalyptus globulus)有效成分总三萜类化合物(eucalyptus triterperoid acid,ETA)(主要含熊果酸〈ursolic acid〉、白桦脂酸〈betulinic acid〉、白桦脂酮〈betulonic acid〉、2α,3β-二羟基熊果酸〈colosolic acid〉)的体外抗肿瘤作用。 方法  用MTT法检测ETA对16种肿瘤细胞株体外生长的抑制作用。 结果  ETA对所试肿瘤细胞株的体外生长皆具有一定的抑制作用,其中对肝癌(HepG2,SMMC-7721,BEL-7402,BEL-7404)、胃癌(SGC-7901,AGS)、结肠癌(LS-174-T,Caco-2)、肾癌(786-0)、肺癌(A549)、宫颈癌(Hela)、乳腺癌(MCF-7)、食管癌(Eca-109)和卵巢腺癌(HO-8910)细胞生长的最大抑制率(MI)均达到85%以上,半数抑制浓度(IC 50 )基本不超过20μg/ml。 结论  ETA具有广谱抑制肿瘤细胞生长作用。
      
  关键词  蓝桉 总三萜类化合物(ETA) 熊果酸 白桦脂酸 白桦脂酮 2α,3β-二羟基熊果酸 MTT 抗肿瘤作用
    
  Antitumor Effects of Triterpenoids in the Fruit of Eucalyptus globulus
     
  Yang Ying,Wu Yutian,Zhu Hongli,et al.

    Shanghai TenGen Biomedical Co.,Ltd.,Shanghai201203.   
     
  【Abstract】 Objective To examine the inhibitory effects of ETA(Eucalyptus Triterperoid Acid)on the growth of some tumor cell lines.Methods MTT assay was adopted to detect the effects of ETA on the growth of different tu-mor cell lines in vitro.Results Results from in vitro MTT experiments show that ETA had inhibitory effect on all the tested tumor cell lines.The growth inhibitory ratio of ETA on the following tumor cell lines reached above85%:A549,Hela,HepG2,SMMC-7721,BEL-7402,BEL-7404,LS-174-T,Caco-2,SGC-7901,AGS,MCF-7,Eca-109and HO-8910.Most of the IC 50 values(concentration required to inhibit cell growth by50%)are less than20μg/ml.Conclusion ETA has inhibitory effects on the growth of many different tumor cell lines in vi-vo.
   
  Key words eucalyptus globules ETA ursolic acid betulinic acid betulonic acid 2α,3β-colosolic acid MTT antineoplastic effect
      
  蓝桉(Eucalyptus globules Labill)是桃金娘科植物,我国三大造林木材之一,主要分布于广东、广西、云南和四川等地。从其叶子中提取出的桉叶油因具有抗菌、抑喘祛痰等多种药理作用而被收录于《中药大辞典》中。蓝桉果实俗称“一口钟”,民间主要用于治疗感冒发烧、抗菌消炎及真菌引起的皮肤病 [1] 。本研究所采用的总三萜类化合物(eucalyp-tus triterperoid acid,ETA)是采用一定工艺从蓝桉果实中提取出的有效部位 [1] ,主要成分为熊果酸(ursolic acid)、白桦脂酸(betulinic acid)、白桦脂酮(betulonic acid)和2α,3β-二羟基熊果酸(colosolic acid)。文献报道三萜类化合物熊果酸和白桦脂酸在单独使用时对肿瘤细胞的生长皆具有一定的抑制作用 [2~4] ;近期文献表明从蓝桉果实中提取出的ETA具有抑制稻瘟酶活性的作用 [1] ,提示ETA可能具有抗癌活性。本研究利用多种肿瘤细胞对ETA进行了体外抗肿瘤谱筛查,探讨其体外抗肿瘤作用。

  1 材料和方法
     
  1.1 材料

     1.1.1 仪器 超净工作台(苏净集团生产)、二氧化碳培养箱(Thermo Forma)、倒置显微镜(重庆光电仪器总公司)、ELISA酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司)。

     1.1.2 药品与试剂 ETA由第二军医大学药学院提供(其中熊果酸(ursolic acid)、白桦脂酸(betulinic acid)、白桦脂酮(betulonic acid)和2α,3β-二羟基熊果酸(colosolic acid)所占比例分别为ETA总量的23.3%、13.2%、26.8%和10.3%)。RPMI1640和DMEM均购自GIBCO公司;小牛血清购自PAA公司。MTT购自Sigma公司;DMSO购自中国医药集团上海试剂公司。阳性对照药5-Fu(10ml:0.25g)由上海旭东海普药业有限公司生产;长春新碱(1mg/支)由上海华联制药有限公司生产。

     1.1.3 细胞株 所用细胞株均购自中国科学院上海细胞资源中心。

  1.2 方法

     1.2.1 药物溶液的配制 ETA以DMSO溶解,使用终浓度为1、3、10、30、100μg/ml。阳性对照药5-Fu和长春新碱采用PBS溶液配制,使用终浓度分别为25、50、100、200、400μg/ml和2.5、5、10、20、40μg/ml。阴性对照为含1%DMSO的相应完全细胞培养液。

  1.2.2 ETA的体外药效细胞实验 以11种不同部位人源性的肿瘤细胞株为研究对象,采用MTT法进行肿瘤细胞生长抑制试验。为确证ETA对肝癌、胃癌和结肠癌肿瘤细胞株的作用,本实验中共采用了4种肝癌、2种胃癌和2种结肠癌肿瘤细胞株进行实验。具体实验方法如下:各细胞株用相应的细胞完全培养液传代培养至对数生长期后,经胰酶-EDTA液消化,调整细胞终浓度为5×10 4 /ml,接种于96孔板中,每孔200μl。于37℃、5%CO 2 培养箱中培养24h后,弃去板上各孔内原有液体,分别换上含有相应浓度药物的完全培养液,各种药物每浓度设6个平行孔。48h后,每孔加入浓度为5mg/ml的MTT溶液20μl。继续温孵4h后,弃去96孔板上各孔中原有液体,每孔再加入DMSO200μl以溶解甲(formazan)沉淀。室温下放置0.5h后,用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光值。按下式计算细胞生长的抑制率:细胞生长抑制率(%)=(对照组吸光值-实验组吸光值)/(对照组吸光值)×100%。
   
  1.3 统计学处理 用Logit回归法求出ETA对各种肿瘤细胞株生长的半数抑制浓度(IC 50 )。
     
  2 结果
    
  体外MTT法实验结果表明,ETA对所试细胞株的生长皆有明显的抑制作用。除K562细胞外,其对其它肿瘤细胞产生的最大抑制率通常大于或等于阳性药5-Fu和长春新碱。除对K562和Du-145的最大抑制率仅达到51.80%和68.42%,且IC 50 值较大外,ETA对其余细胞株的最大抑制率均达到85%以上,IC 50 值均在20μg/ml左右。ETA对所选用的4种肝癌细胞株Hep G2、SMMC-7721、BEL-7402和BEL-7404的最大抑制率分别为94.13%、95.12%、87.25%和92.93%,相应的IC 50 值分别为10.42、9.79、11.5和8.84μg/ml;对所选用的2种胃癌细胞株SGC-7901和AGS的最大抑制率分别为89.27%和88.19%,相应的IC 50 值分别为7.08和6.61μg/ml;对所选用的2种结肠癌细胞株LS-174-T和Caco-2的最大抑制率分别为88.08%和93.05%,相应的IC 50 值分别为9.55和7.24μg/ml。提示ETA对上述3种类型的肿瘤细胞株具有较明确的生长抑制作用(见Table1,2)。
   
  Table1 The maximum inhibition ratio(略)

     Table2 The IC 50 of ETA on cultured tumor cell lines略
    
  3 讨论
    
  目前我国对蓝桉叶、根、皮等的药理研究和临床应用已比较成熟,但是对蓝桉果实“一口钟”研究却较少。陈斌等 [1] 经研究发现用石油醚或乙酸乙酯从其果实内提取出来的物质具有较好的抗菌活性和抑制稻瘟霉活性;经化学成分研究证明从上述两种溶剂中提取得到的物质为总三萜类化合物(ETA),其内主要成分为熊果酸(ursolic acid)、白桦脂酸(betulinic acid)、白桦脂酮(betulonic acid)和2α,3β-二羟基熊果酸(colosolic acid);各成分在ETA中所占比例分别为23.3%、13.2%、26.8%和10.3%,上述4种成分占ETA总量的73.6%。
   
  熊果酸具有抗突变、抗促癌及抗肿瘤增殖的作用,早已引起了国内外学者的广泛注意。黄镜等 [3] 经研究后认为熊果酸可能是通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。黄炜等 [5] 以克隆化高转移人肺癌细胞(PGCL3)为材料进行研究后发现,熊果酸除具上述作用外还具有抗肿瘤侵袭作用,究其原因认为可能是通过对癌细胞粘附作用、趋化运动和组织蛋白酶B分泌的抑制而实现的。王兵等 [6] 以培养血管内皮细胞(VEC)为材料,研究后发现熊果酸对体外血管形成具有抑制作用。相洪琴 [4] 报道白桦脂酸有抗黑素瘤的作用。另有文献研究表明部分三萜类物质及其衍生物皆具有一定的抗肿瘤活性 [7、8] ,且某一三萜类物质的同系物之间的抗肿瘤活性虽存在有强弱之分,但由于混合物之间可能存在的协同作用,故其测出的抗肿瘤活性却总是比单一化合物强。
   
  因蓝桉果实提取物(ETA)中含有熊果酸、白桦脂酸及其衍生物等三萜类物质,为探讨其可能具有的医学用途,本研究按国家抗肿瘤药物体外筛选的相关规定,采用经典的MTT法对ETA的体外抗肿瘤作用进行系统观察。

  实验结果表明ETA对所选用的16种人源性肿瘤细胞的体外增殖均显示出较强的抑制作用;除Du-145和K562细胞外,ETA对各肿瘤细胞半数抑制浓度(IC 50 )基本均小于20μg/ml,小于一般认为的30μg/ml的有效界限 [7] 。另为确证ETA对同一种类不同类型肿瘤细胞株的作用是否一致,本研究中选用了4种肝癌、2种胃癌和2种结肠癌肿瘤细胞株进行实验,结果表明在所选用的肿瘤细胞株中ETA对同一种类的不同类型肿瘤细胞株的作用基本一致,且IC 50 均在10μg/ml左右。提示从蓝桉果实中提取出来的总三萜类化合物(ETA)具有广谱抗肿瘤细胞生长作用,且其对肝癌、胃癌和结肠癌肿瘤细胞株的体外增殖具有显著的抑制作用。
    
  参考文献
    
  1 陈斌,朱梅,邢旺兴,等.蓝桉果实化学成分的研究.中国中药杂志,2002,27(8):596-597.

     2 Lee KH,Lin YM,Wu TS,et al.The cytotoxic principles of prunella vulgaris,psychotria serpens,and Hyptis capitata:ursolic acid and re-lated derivatives.Planta Med,1988,54(4):308-311.

     3 黄镜,孙燕,陆士新,等.芦笋有效成分熊果酸诱导HL-60细胞凋亡的实验研究.中国中西医结合杂志,1999,19(5):296-298.

  4 相洪琴.白桦脂酸抗黑素瘤有效.国外医学情报,1996,17(4):3.

  5 黄炜,黄济群,张东方,等.五环三萜类化合物抗人肺癌细胞侵袭和诱导细胞凋亡的研究.中国肺癌杂志,2003,6(4):254-257.

  6 王兵,王杰军,徐钧,等.熊果酸对体外血管形成的抑制作用.肿瘤防治杂志,2001,8(4):351-352.

     7 张嘉岷,曹莉,吴争鸣,等.竹节香附中三萜类成分的抗肿瘤活性研究.中国新药杂志,2003,12(3):191-193.

     8 白育军,杨小生,康文艺,等.熊果酸的结构修饰及其抗肿瘤活性.华西药学杂志,2003,18(2):87-90.    

   基金项目:上海市科委中药现代化研究基金(03DZ19509)资助项目

    作者单位:1 201203上海天甲生物医药有限公司
  
       2 200433第二军医大学药学院

    (收稿日期:2004-09-12) (编辑清 泉)

作者: 杨英吴玉田朱洪莉娄子洋谢天培刘玉明顾心彬季红光戈萌薛锦祥宋晓冬 2005-8-3
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